大肠杆菌菌株感受态制备_电击转化及转化效率检测.docVIP

大肠杆菌DH10B（Streptomycin resistant）电转化感受态制备 从保存的甘油管中取出200 ?L菌液到100 mL的LB液体中，37oC，200 rpm培养约13~16小时后（对数期），按2%接种到SOB培养基中； 37oC，约2~2.5小时后，OD600约0.5左右，取出，冰上缓慢摇育30 min。 预先4oC降温的冷冻离心机离心收集菌体，用预冷的离心管，并时刻保持在冰上，5000 rpm离心5 min； 用50~60 mL的冰预冷灭菌超纯水洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时刻保持在冰上，第二次洗时可以将2管的菌体并到一管，水洗过程离心的转速要高一些，约6000 rpm离心5 min，因为离心得不是很实，离心完后要立即倒掉上清，以免菌体重新悬浮造成损失； 用50 mL的冰预冷灭菌10%甘油洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时刻保持在冰上，离心后立即倒掉上清； 最后一次甘油洗涤后立即倒掉上清，视菌体量加入0~x ?L的10%冰预冷甘油重新悬浮细胞，75~200 ?L/管,分装到预冷的离心管中，电转化或立即放入-80oC冰箱保存，该感受态可以在-80oC保存半年。 SOB培养基（1L）： 20 g Tryptone；5 g Yeast Extract；0.6 g NaCl；0.19 g KCl，8磅灭菌20 min。 注意事项： 种子一定要新鲜，最好是从甘油管中直接液体活化的。 OD600控制在0.5左右，建库用的话千万不要过！过了0.6感受态效率不会太高，做一般克隆和质粒转化的要求可以适当放低。 菌体时刻保持冰上（4 oC以下）！尽量减少离开冰的时间。 最后分装的菌体浓度要浓。 对待菌体要尽量轻柔。 收集菌体用的管和枪头要灭菌，并在超净台操作。 电击转化 75 ?L的感受态细胞加入TE溶解的质粒和连接产物最好不要超过0.6 ?L，不然容易击穿，如果质粒是用纯水溶解的可以适当提高，冰上放置10~30 min； 洗干净并烘干的电转杯冰上预冷，快速将上述感受态细胞转到电转杯里，感受态细胞要位于杯子底部； 此步骤动作要快：将杯子外壁擦干，2 mm的杯子用电转化程序Ec2，1 mm杯子用电转化程序Ec1，电击后立即加入900~1000 ?L37oC预热的SOC（见分子克隆），轻柔吸打，转到2 mL的离心管中，37oC摇床，150 rpm，45~60 min后取适量涂平板。 感受态细胞转化效率检测 取已知浓度的pUC19质粒（例如0.1 ng/?L）0.2 ?L到制备好的75 ?L感受态细胞中，按上述方法转化； 转化后取1 ?L涂氨苄LB平板，37oC过夜； 数平板上的菌落数，转化效率为每微克DNA（即质粒）转化所长出的单菌落数，即cfu/?g。举例说明：平板上长出750个单菌落，则转化效率 750 cfu÷[ 0.2 ?L×0.1 ng/?L ÷1000] 3.75×1010 cfu/?g 建库用的感受态效率要大于108 cfu/?g DNA。