免疫学课件——第十一章中和试验讲解.pptVIP

第十一章 中和试验 病毒或毒素与相应的中和抗体结合后,可使其失去致病能力,此种中和反应有严格的种,型特异性,而且还可以定量,所以可以定性,定量检测病毒,毒素或抗体. 中和试验是以病毒或毒素对生物系统的毒力为基础的,所以首先根据病毒,毒素特性选择合适的细胞,鸡胚或试验动物,测病毒,毒素对其毒价,再测抗体中和后的毒价,如果毒价有较明显的变化,说明抗原,抗体发生了反应,即抗体对病毒或毒素发生了中和.而且还可以根据毒价的变化,来判断血清中抗体中和病毒或毒素的能力—中和价(抗体的定量) 一.毒价滴定 毒价单位: MLD:最小致死量 LD50:半数致死量 ID50:半数感染量 RD50:半数反应量 ELD50:鸡胚半数致死量 EID50:鸡胚半数感染量 TCID50:组织培养半数感染量 毒价的表示: 通常以每毫升(克)含有多少个LD50(或TCID50)来表示.如某毒素的毒价为105.2TCID50/ml. 半数计量的计算: 将病毒液10倍稀释,选择4-6个稀释度接种试验动物(细胞培养物,鸡胚),每组3-6只(管),观察一定时间内的死亡(或细胞病变)情况,绘制表格,计算半数计量. 计算方法(内插法): lg10-5-lgTCID50 88%-50% = lg10-5-lg10-6 88%-29% lgTCID50=-5.64 TCID50=10-5.64,0.1毫升 上述病毒价为每毫升含106.64TCID50 二.终点法中和试验 1.固定病毒稀释血清法(定性,定量) 先滴定病毒的病毒价,然后将其稀释成每一单位计量含200LD50(或EID50,TCID50),与等量的递进稀释的待检血清混合,混合后37℃1小时,每一稀释度接种3-6只试验动物(或鸡胚,细胞培养),用与计算毒力相似的方法(Karber法),计算PD50(半数保护量),即该血清的中和价. 血清稀释:1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 10-1 10-1.3 10-1.6 10-1.9 10-2.2 保护比值:3/3 3/3 3/3 0/3 0/3 带入公式:lgPD50=L+d(S-0.5) S为保护比值之和(3/3+ 3/3+ 3/3+0/3+0/3) L为最低稀释度的系数(lg10-1) D为组距(lg10-1.3-lg10-1) 中和价为10-1.75=1/60 2.固定血清稀释病毒法(定性,定量) 将病毒原液作10倍稀释,分装两列试管,第一列加等量正常血清(对照),第二列加等量待检血清,混合后37℃1小时,分别接种3-6只试验动物(或鸡胚,细胞培养),分别计算LD50和中和指数. 中和指数=中和组LD50/对照组LD50 中和指数50为阳性,10-49为可疑,10为阴性 3.空斑减少试验 本法应用空斑技术,使空斑数减少50%的血清稀释度作为中和滴度. 先将病毒稀释成每一接种计量含100空斑单位(PFU),加等量稀释的血清,37℃1小时.每一稀释度接种3个已形成单层细胞的空斑瓶,同时用同样稀释的病毒加等量的Hanks液作为对照. 空斑减少法中和试验 病毒稀释液 100PFU/0.5毫升 病毒加Hanks液对照 55PFU 血清稀释 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 10-1 10-1.3 10-1.6 10-1.9 10-2.2 10-2.5 中和后空斑数 5 11 15 29 40 50 中和比值 50/55 44/55 40/55 26/55 15/55 5/55 血清中和价(lg)=L+d(S-0.5) =-1-0.3(3.4-0.5) =-1.87 中和价为 10-1.87=1/74 免疫学原理与技术 * 0 0/11 11 0 0 6 0 10-7 29 2/7 5 2 33 4 2 10-6 88 7/8 1 7 83 1 5 10-5 100 13/13 0 13 100 0 6 10-4 % CPE率 无CPE数 CPE数 % 无CPE数 CPE数 累计结果 观察结果 病毒稀释 病毒毒价滴定(接种计量0.1毫升) 注:CPE为细胞病变 免疫学原理与技术