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神经解剖学研究方法的发展和变迁 第一节 传统的神经解剖学研究技术 一、Golgi 法 Camello Golgi 1843-1926 , 意大利人，1883年创建了用重铬酸钾-硝酸银镀染整个神经元的方法；他称为“黑色反应”。 缺点：稳定性差 二、Cajal 法 Ramon y Cajal 1852-1943 , 西班牙人，1903年创建了吡啶银镀染神经元内的神经原纤维的Cajal法。 Golgi 和Cajal于1906年共同获得诺贝尔生理学和医学奖。 重铬酸钾或锇酸处理组织 ，在放入硝酸银，后用对苯二酚或甲醛还原银，故称还原银法. 三、Nissl 法 Franz Nissl 1860-1919 , 德国人，1892年创建了Nissl法。 四、Weigert 法 Karl Weigert 1843-1904 , 德国人，1884年创建了髓鞘染色法。将组织投入金属化合物，后行苏木素染色，髓鞘呈蓝黑色。 五、Marchi 法 Vittario Marchi 1851-1908 , 意大利人，1890年创建了用锇酸显示变性髓鞘的Marchi法。 缺点：神经终末显示不清 六、Gless 法、Nauta法、Fink-Heimer法 用镀银染色的原理，显示正常的无髓或薄髓纤维以及变性纤维，乃至其终末前节段的染色方法。 七、其它染色方法 H-E 染色 锇酸的髓鞘染色法 第二节 标记法的出现—20世纪70年代神经解剖学研究方法的革命性变化。 一、HRP标记方法 辣根过氧化物酶 horseradish peroxidase, HRP HRP的特点:被髓鞘和末梢吸收，逆行；也可被细胞霍树突吸收，顺行。 HRP的纯度值（RZ值） 二、其它示踪方法 放射自显影法：14C 荧光素示踪技术: 病毒示踪技术: 第三节 化学神经解剖学 免疫学与组织化学原理结合的结晶-化学神经解剖学 甲醛诱发荧光法：单胺类 酶组织化学：乙酰胆碱酯酶 3. 免疫组织化学染色法 （1）直接法 （2）间接法 A：PAP peroxidase anti-peroxidase 法 B：ABC avidin-biotin-complex 法 4. 免疫荧光组织化学染色 5. 原位杂交：检测 DAN, RNA 6. 受体定位方法 7. 免疫电子显微镜技术 第四节 综合运用神经科学各个分野研究手段的展望 思考题 传统神经解剖学研究方法各有什么优缺点？ HRP示踪技术的原理和基本步骤是什么？ 免疫组织化学染色的基本原理是什么？ 怎样检测同一个神经元内是否含有两种以上的神经递质？ 什么叫受体？怎样检测神经元存在受体？ BCIP/NBT 无色底物 蓝色沉淀 染色系统 磷酸酶 抗地高辛抗体 地高辛半抗原 连接臂 地高辛标记探针 靶DNA序列 地高辛标记的原位杂交原理图 同位素标记的原位杂交结果 同位素标记的原位杂交结果-暗视野 免疫组织化学染色（ABC法） 8. 共聚焦显微镜 9. 原子力显微镜 10. PCR End 研究结果 ？ H-E 染色 锇酸髓鞘染色 Fast Blue 染色 HRP标记方法的种类 A：逆行标记 B：顺行标记 C：跨节标记 HRP 逆行示踪法 DAB显色 HRP 跨节示踪法 TMB显色 免疫组织化学染色方法的比较 A：直接法 B：间接法 Peroxidase anti-peroxidase PAP 法 第一抗体 第二抗体 PAP 复合物 HRP 第一抗体 第二抗体 Avidin Biotin HRP Avidin-Biotin-Complex ABC 法 免疫组织化学染色（PAP法） 免疫组织化学染色（ABC法） 免疫组织化学染色（ABC法） 间接免疫荧光组织化学染色法示意图 二 抗原 荧光标记物 第二抗体 第一抗体 免疫荧光组织化学染色 免疫荧光组织化学双重染色 标记的cDNA、 cRNA探针 蛋白质前体 mRNA及核糖体 cDNA TAGCA AUCGU UAGCA AUCGU mRNA cRNA 神经元 原位杂交组织化学技术基本原理 使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链 在细菌或其他真核细胞中的位置 组织在干冰中速冻 恒冷箱切片 杂交前处理 杂交 湿盒 杂交后冲洗、 涂乳胶 微观放射自显影 干燥 置暗盒中曝光 宏观放射自显影 干燥 置X光片匣中曝光 原位杂交组织化学基本步骤 * Golgi 法，小脑梨状神经元 大脑皮质锥体细胞 神经细胞 树突 神经纤维 神经原纤维 胶质细胞核 Cajal 法 Cajal 法 Nissl 法 脊髓前角运动细胞 小脑皮质 Weigert 法 小脑皮质 Weigert 法 脊髓横断面 Marchi 法 延髓锥体交叉 Gless法 Nauta 法示终