海洋真菌MF―08产壳聚糖酶诱导条件及酶学性质分析.docVIP

海洋真菌MF―08产壳聚糖酶诱导条件及酶学性质分析 　　摘要：通过研究不同摇床转速、不同碳源和碳源浓度、不同诱导碳源对海洋真菌MF-08产壳聚糖酶的影响，提高其产酶活性，并对海洋真菌MF-08产壳聚糖酶进行部分酶学性质研究。结果表明，最佳发酵条件为27℃，150 r/min，1.5%蔗糖，0.01%氨基葡萄糖，海水培养基发酵72h。该壳聚糖酶的最适作用温度为40℃，最适pH 5.2，酶活在pH 4.0～6.0范围内和0～40℃相对稳定；Cu2+、Fe3+和Hg2+对该酶活具有明显的抑制作用。经过培养条件的优化，该菌的最高产酶活性达到1.769 U/mL，与优化前相比提高了7.56倍。 　　关键词：海洋真菌MF-08；壳聚糖酶；诱导条件；酶学性质 　　壳寡糖是甲壳素脱乙酰化后的产物，是一种具有独特生理活性的低聚糖，属于阳离子型天然碱性多糖，这使得壳聚糖具有许多特殊的物理、化学性质及生理和药理功能。具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活等独特的生理功能，其应用前景广阔。壳聚糖在自然界广泛存在于虾、蟹及少数菌类、藻类的细胞壁中，在高等植物中还未发现壳聚糖的存在，也可由几丁质通过部分或完全脱乙酰而成，在食品、医药、农业和环保等领域有着广泛的应用价值。降解壳聚糖的方法有化学法、物理法、酶解法、电化学法等，其中酶解法具有特异性强、节能、环保、安全等优势。壳聚糖酶是一种降解壳聚糖的专一性水解酶，是理想的壳聚糖降解方法。利用酶法降解壳聚糖的研究还处在实验室研究阶段，难以实现工业化生产，关键在于尚未研究出有效获得大量的、专一性的壳聚糖酶制剂的方法。 　　本试验以一株产壳聚糖酶活力较高的海洋真菌为出发菌株，研究其培养条件对产酶的影响及壳聚糖酶学性质的研究，以期为壳聚糖酶工业化生产及应用提供试验依据和理论基础。 　　1.材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1菌种 海洋真菌MF-08：大连工业大学微生物实验室分离保存。 　　1.1.2培养基 试管斜面培养基：1.0%葡萄糖，0.5%壳聚糖，0.2%蛋白胨，0.1%酵母膏，40%蒸馏水，60%陈海水，2%琼脂，自然pH，115-120℃，灭菌20 min，冷却待用。 　　发酵培养基（g/L）：碳源1.0%；酵母膏0.1%；蛋白胨0.5%：FePO4 0.01%：陈海水100 mL；pH 7.6；在115-121℃灭菌20 min，冷却待用。 　　液体种子培养基（g/L）：在无菌试管中装入5 mL发酵培养基，在115-121℃灭菌20 min，冷却待用。 　　无金属离子培养基：蔗糖1.5%：酵母膏0.1%；蛋白胨0.5%：去离子水100 mL；自然pH；在115-121℃灭菌20 min，冷却待用。 　　1.1.3仪器 不锈钢手提式蒸汽灭菌锅，上海博讯仪器厂；双层小容量全温度恒温震荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；722 s分光光度计，上海精密仪器科学有限公司；TGL-16C型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；MJP-150型霉菌培养箱、DK-S24型电热恒温水浴锅；DGG-9070B型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司。 　　1.2方法 　　1.2.1粗酶液的制备 从保藏的试管斜面挑取孢子于液体发酵培养基中，37℃振荡培养72 h，取一定量发酵液，8 000 r/min离心15 min，其上清液即为粗酶液。 　　1.2.2酶活力测定方法 1 mL含壳聚糖0.5%（0.5g/100 mL）的乙酸缓冲液，加入1 mL粗酶液，37℃下保温30 min，煮沸5 min终止酶反应。DNS法测定还原糖。相对酶活是以同组试验的最高酶活性为1，其他酶活性与最高酶活的比值即为相对酶活。剩余酶活是经过一定处理后的酶活/原来的酶活。 　　1.2.3发酵培养的方法 在超净工作台内，从保存的试管斜面上挑取孢子，接入5 mL液体种子培养基中，27℃、150 r/min振荡培养24h。再接入对应装有45 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，27℃、150 r/min振荡培养72 h。考察不同摇床转速（0、50、100、150、180 r/min）、不同碳源（蔗糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、D-甘露醇、粉末性壳聚糖、可溶性壳聚糖）及碳源浓度（0.50%、1.00%、1.50%、2.00%）、不同诱导性碳源（氨基葡萄糖、胶体壳聚糖、粉末壳聚糖）及碳源浓度（0.01%、0.30%、0.50%、0.70%、0.90%）对海洋真菌MF-08产壳聚糖酶的影响。 　　1.2.4酶学性质的研究方法 　　1）最适反应温度及温度稳定性：在不同温度（30、35、40、45、50、55、60、70、80℃）下测定酶活，以确定最适反应温度。将粗酶液分别置于不同温度的恒温水浴中保温10 min，然后