蛋白质分子量的测定.docVIP

實驗一 蛋白質分子量測定- SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳 一、實驗目的： 學習SDS測定蛋白質分子量的原理 掌握SDS測定蛋白質分子量的操作方法 二、實驗原理： 電泳技術在定大分子特徵及分析其純度方面已成基本工具。此法基於這事實，即 DNA，RNA及蛋白質等分子具有電荷，於電場中可以移動。早期的電泳在蔗糖溶液中進行，但此法笨重設備又貴而限制其適用性。以澱粉膠取代蔗糖做支持媒體與抗對流劑增加了電泳在生物問題上的應用，但直到丙烯醯胺膠的好處被挖掘後此法才蓬勃發展。 蛋白質因其所具酸性(glutamic及aspartic acid)與鹼性(lysine及arginine)胺基酸而具電荷。整個分子也只顯示其淨電荷而已。若一具純電荷q的分子置於電場，作用於其上的力F的大小，要視分子所攜電荷與其間電場強度多少而定。以數學法表示 其中 E是電極間位差，d是距離；E/d 通常稱場強度。在真空之下分子會加速向著電荷，最後撞擊之。在溶液則不如此，因電場拉力被加速分子與溶液間的拖力或摩擦力抵抗。拖力大小要視分子大小與形狀及其間媒介黏性而定，故得Stoke’s方程式： 其中 r為圓形分子的拖力，(為溶液黏度，v為分子移動的速度。由上式可得知分子移動速度v與電場強度及分子上電荷成正比但與其自身大小和溶液黏度成反比。 電泳只需兩件儀器：(1)直流電源與(2)緩衝劑容器(貯池)系。此系含上下緩衝劑貯池以供含聚丙烯醯胺膠的管子懸於其間。注意二容器間的電接通僅經過丙烯醯胺而已。 一組大分子(如蛋白質)的電泳分離，是將高密度成分，用來防止樣本與上層容器緩衝劑(與丙烯醯胺膠表面接觸)相混合。在電泳常用的pH 9下，大部分蛋白質呈負電性，因陽極在下容器，等電一開，蛋白質向正電荷的陽極移動。通常樣品中有「追蹤染料」如溴酚藍做為參考。此種有色物質動得比任何大分子都快。故當電泳繼續之中僅有染色抵達管底你才可以合理地確定所有大分子仍在膠內。若分子的分開移動甚慢就可能要測定染料穿越管子的時間，再繼續電泳分離達數倍於此時間。至於幾倍要看欲分離分子而定，只能以試誤法進行。 蛋白質在丙烯醯胺膠中的移動為其淨電荷差異與大小的函數。理論上來說，兩蛋白質若其大小的差異為電荷差異所補償則應以相同速率移向陽極。因此丙烯醯胺膠電泳若如前所述使用一種孔洞大小者，無法獲得分子的分子量方面資料。以下將敘述使用多種孔洞大小的技術。電泳技術的第二個限制是在膠上觀測得的物種數目方面。緊密結合(但非共價性地)複分子在電泳過程中常不能分開。故電泳中出現的蛋白質或RNA區帶數僅能代表實存之中數目的最低可能。為了克服這些問題，Shapiro等人試著將一種陰離子除垢劑硫酸十二酯鈉(SDS)加入後分離蛋白質混合物。他們初步努力的結果促使Osborn添加SDS來測定約40種蛋白質的游動性。發現實驗中這些蛋白質的游動與SDS已知可與蛋白質厭水區結合，而將它們大都以成分亞單位的方式分開。若一蛋白質的成分亞單位為雙硫鍵連結，此鍵可在電泳前以SDS及(-巰基乙醇((-mercapto ethanol)加熱打斷，還原成巰基團(SH)。這些基團再用適當的烷化劑遮斷以防止雙硫鍵復原。雖說分子量12000與70000 Da之間的蛋白質游動較宜，卻也有的曲線見於游動性對蛋白質分子量在40000至200000 Da的對數的圖形中。此無疑為研究者使用減量的交聯劑[N,N’-methylene-bis(acrylamide)]。在SDS-丙烯醯胺膠電泳(SDS)方法中，用在蛋白質分子量測定時要將三或四種分子量高或低於未知物的標準蛋白質(Protein Marker)拿來同時做，以此法括住未知蛋白質產生了標準的直線圖，而未知樣品適當地列在其中以測知其分子量。 SDS是PAGE的一種特殊型式，SDS是帶負電荷的陰離子去污劑。用SDS測定蛋白質分子量時，蛋白質需經樣品溶解液處理，在樣品溶解液中含有巰基乙醇及SDS，各種蛋白質樣品在巰基乙醇作用下，還原成單鏈，再進一步與SDS結合形成帶大量負電荷的SDS-蛋白質複合物。因此各種蛋白質分子在SDS中，只能按其分子量大小而分離。 SDS有連續體系及不連續系兩種，這兩種體系有各自的樣品溶解液及緩衝液，但加樣方式，電泳過程及固定、染色與脫色方法完成相同。 電泳技術的廣泛應用已需要發展一種方法來用在看見大分子在丙烯醯胺膠上分離，方法如下： Coomassie 亮藍染色 最常用的蛋白質染料是Coomassie 亮藍。此染料由於更大的敏感度(尤其有SDS存在時)而取代了廣用的醯胺黑。此法廣用的變化是同時染色與固定蛋白質。可在1.25g Coomassie 藍溶於454mL 50%甲醇與46mL冰醋酸混合液中將膠浸泡2至10小時。使用之前要很小心地