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细胞分离与破碎 林贝 一、细胞分离 重力沉降 离心沉降 差速离心分级 区带离心 过滤 区带离心 二、细胞破碎 细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。 １．细胞结构 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。 细菌 细菌 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。 1、革兰氏阴性：肽聚糖（薄）-脂蛋白，脂多糖---最易 2、革兰氏阳性：肽聚糖（厚） 酵母细胞壁的结构示意图 与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 红面包霉菌(Neurospora crassa)的细胞壁结构示意图 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 ２．细胞破碎技术 细胞破碎是为目标产物的释放创造条件，为了最大程度的获得活性产物，而不是最终目的。 最终目的是释放目标产物。 每一步都应注意操作度、对细胞的剪切程度、蛋白酶的失活等全面考虑。 在选择细胞破碎时也要考虑后面的各步。 ２．细胞破碎技术 （一）机械破碎法 　高压匀浆破碎法　珠磨、撞击破碎法、超声波破碎法 （二）非机械破碎法 　渗透压冲击破碎法　冻融破碎法　酶溶破碎法　化学渗透法 (三)多种破碎法结合 高压匀浆器（High pressure homogenizer） 细胞破碎技术 特点 高压匀浆法适用的范围： 　酵母和大多数细菌细胞的破碎。料液细胞质量浓度可达到200g/L左右。 ☆团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高压匀浆法。 一次高压匀浆只有部分细胞破碎，获得100％的破碎需要数次破碎。 过度破碎细胞造成产物损失，细胞碎片的变小影响后面的破碎。 高压匀浆法使用时注意事项 高压匀浆器的操作温度上升约２－３℃/10MPa 为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。 多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。 珠磨-珠磨机 (1) 珠磨机操作原理 微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂（通常是d1mm的无铅玻璃珠）在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释出内含物。 在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，桨液流出，从而实现连续操作。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。 特点 超声波破碎 空化作用 超声波空化作用是指存在于液体中的微气核空化泡)在声波的作用下振动，当声压达到一定值时发生的生长和崩溃的动力学过程。空化作用一般包括3个阶段：空化泡的形成、长大和剧烈的崩溃。当盛满液体的容器当通入超声波后，由于液体振动而产生数以万计的微小气泡，即空化泡。这些气泡在超声波纵向传播形成的负压区生长，而在正压区迅速闭合，从而在交替正负压强下受到压缩和拉伸。在气泡被压缩直至崩溃的一瞬间，会产生巨大的瞬时压力，一般可高达几十兆帕至上百兆帕。 Suslick等人测得：空化可使气相反应区的温度达到5 200 K左右，液相反应区的有效温度达到1 900 K左右，局部压力在5．O5× 10 kPa，温度变化率高达10。K／s，并伴有强烈的冲击波和时速达400 km 的微射流。这种巨大的瞬时压力，可以使悬浮在液体中的固体表面受到急剧的破坏。 特点 超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。操作简单，液量损伤少。 超声波破碎法的有效能量利用率极低，处理量少；操作过程产生大量的热，因此需在冰水或有外部冷却的容器中进行。 超声处理中产生的自由基使一些敏感物质变性失活。 由于对冷却的要求相当苛刻，不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。 渗透压冲击法 将细胞置于高渗透压的介质中，达到平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的缓冲水溶液中。在渗透压的作用下，水穿越细胞壁和膜进入细胞，使细胞壁和膜膨胀破裂。 渗透压冲击是在各种细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易于破碎的细胞。 特点 处理条件比较温和，有利于目标产物的高活力释放、回收。 该方法破碎效率较低。 产物释放速度低 处理时间长 不适于大规模细胞破碎的需要，多局限于实验室规模的小批量应用。 酶溶法 利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁消化溶解，受到部分或完全破坏的方法。 溶菌酶适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解。对于革兰氏阴性菌需辅以EDTA。 真核细胞的细胞壁需采用不同的酶。 蜗牛酶适于酵母细胞的处理。 通过调节温度、pH或添加有机溶