核酸与蛋白质的研究方法讲解.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 细菌转化与目标DNA分子的增殖 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。 提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 转化(transformation) 特指以质粒DNA或以它为载体构建的重 组子导入细菌的过程。 转染 (transfection) 是指噬菌体、病毒或以它作为载体构成的重组子导入细胞的过程。 转导 (transduction) 以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程。 上述概念往往容易混淆。 转化是一个自然存在的过程。细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。 重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。 这项技术始于Mandel和Higa 1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后，容易被λ噬菌体DNA感染，随后Cohn于 1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也可进入细菌。 转化原理： 将快速生长中的大肠杆菌置于经0℃预处理的低渗氯化钙溶液中，使细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，易与外源DNA相粘附并在细胞表面的复合物。 42℃下做短暂热刺激，复合物便会被细胞所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化子。 λ噬菌体可以作为克隆载体 聚合酶链反应技术（PCR） 首先将双链DNA分子加热分离成两条单链，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种dNTP合成新生的DNA互补链。 因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动（“引导”）新链的合成，所以，新生DNA链的起点由寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点所决定。 整个PCR反应的全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA相结合（退火）、DNA合成（链的延伸）三步，可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。 PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较。 主要步骤： 将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。 然后降低反应温度（约50℃），致冷1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。 最后，将反应混合物的温度上升到72℃左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5→3方向延伸，合成新生DNA互补链。 实时定量PCR（Real time-PCR） 普通PCR扩增产物总量变化大。 实时定量PCR技术：利用带荧光检测的PCR仪对PCR过程DNA累积作出动态监测。 荧光染料： SYBR Green I TaqMan探针 实时定量PCR（Real time-PCR） 基因组DNA文库构建 基因组 DNA文库构建：把某种生物基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。 汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆，称为基因组DNA文库。 常用载体：?噬菌体；柯斯质粒；BAC；PAC；YAC RNA基本操作技术 在DNA水平上分离真核生物的靶基因难度大：基因组DNA庞大；大量重复序列；有内含子。 而分离mRNA?cDNA?目的基因工作简单，速度快。 但是，RNA分子：敏感，稳定性差，某些基因的mRNA具有时相和转录的特殊性。 总RNA的提取 1、操作要求高：选择合适的时相、采用适当的条件与材料，避免降解。 2、方法： Trizol法。由苯酚和异硫氰酸胍组成，可迅速破坏细胞结构，使RNA释放，并保持RNA完整。 3、浓度和纯度鉴定： 通过OD260/OD280的比值来鉴定 mRNA的纯化 根据mRNA3’端具有polyA尾巴的特点，利用寡聚（dT）-纤维素柱色谱法纯化获得高纯度的mRNA。 PolyATtract mRNA的分离纯化过程简图 cDNA的合成 使用oligo dT或随机引物，通过