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T―RFLP分析不同森林类型土壤真菌组成及分布 　　摘要：在长白山森林生态系统定位站，利用T-RFLP技术研究了6种不同森林类型土壤真菌组成及其分布特征。结果表明，6种不同森林类型土壤真菌多样性指数以白桦林中后期最高，过熟阔叶红松林次之，杨桦成熟林最低。不同森林类型的真菌群落相似度也很低，其数量、类型及分布均存在着差异。 　　关键词：土壤；真菌；DNA提取；ITS-PCR；T-RFLP 　　中图分类号：Q938.1+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1443-04 　　土壤微生物是森林生态系统中最重要的组分，在凋落物分解、腐殖质合成以及养分循环等过程中起着十分重要的作用。其种类和组成不仅直接影响土壤的生物化学循环，而且是土壤生物活性的具体体现，并在森林生态系统的物质循环和能量流动中扮演着重要角色[1-3]。不同土壤分布着不同的土壤微生物，而不同的微生物多样性又影响土壤功能的多样性[4]。土壤微生物的组成和分布可以在深层次上揭示森林生态系统的物质循环和能量流动。目前测定土壤微生物多样性的方法主要有稀释平板法、磷脂脂肪酸分析（PFLA）法、Biolog微平板分析法及分子生物学方法等[5]。随着分子生物学技术在土壤微生物研究中的不断发展，土壤微生物多样性的研究有了新的突破。核糖体ITS区为非编码区，受到的选择压力较小，进化速度快。因此该区段能够提供比较丰富的变异位点和信息位点，目前已经用于种间、亚种和种群水平上的遗传多样性研究[6]。自从Innis等[7]1990年首先设计ITS引物对真菌核内核糖体RNA基因进行扩增以来，ITS序列分析技术在真菌分类、鉴定的研究中应用越来越广泛。 　　该研究利用分子生物学技术对长白山自然保护区不同森林类型的土壤真菌群落组成进行分析，比较不同植被类型与土壤真菌之间的关系及变化趋势，以期加深对土壤真菌变化过程和机制的认识，为长白山区域天然林保护和生态建设提供基础资料。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　土壤样品于2010年10月采自长白山自然保护区（表1）。按不同林型采用对角线型混合取样法采集表层的土壤，采集深度为0～5 cm，用塑料袋封装带回。-80 ℃下密封保存。 　　1.2 试剂与仪器 　　Taq DNA 聚合酶、dNTPs、限制性内切酶Hinf Ⅰ购自宝生物工程（大连）有限公司；土壤真菌基因组提取试剂盒购自MoBio Laboratories公司；DNA纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。Gene-9700型PCR扩增仪、上海卢湘仪台式离心机、BIO-RAD凝胶成像系统等。 　　1.3 方法 　　1.3.1 土壤样品DNA的提取与检测 土壤样品DNA的提取参照MoBio土壤真菌提取试剂盒的方法。 　　1.3.2 ITS-PCR扩增及产物纯化 用于ITS片段扩增的引物采用真菌ITS区通用引物ITS1-F和ITS4，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体序列如下：ITS1-F（5′→3′）：CTTGGTCATTTAGAGG 　　AAGTAA；ITS4（5′→3′）：TCCTCCGCTTATTGATAGC。 　　ITS扩增反应体系为：5 μL 10×PCR Buffer（50 mmol/L KCl；10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mmol/L MgCl2）、2 μL DNA模板、ITS1-F和ITS4（10 μmol/L）各2.5 μL、4 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH2O至50 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；最后72 ℃延伸8 min。取5 μL ITS-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像处理系统观察拍照。 　　1.3.3 ITS-PCR产物的纯化 采用DNA纯化试剂盒，按照说明书进行PCR产物纯化。 　　1.3.4 ITS-PCR产物的限制性酶切分析 ITS-PCR产物的T-RFLP分析反应体系为30 μL：含10 μL ITS-PCR产物、2 μL Hinf I（10 U/μL）、3 μL 10× Buffer、加ddH2O至30 μL。置于37 ℃水浴中酶切反应4 h，然后65 ℃作用20 min终止反应。将酶切产物送至上海美吉生物医药有限公司测序。 　　1.3.5 数据分析 每个T-RFLP的丰度百分比（Ap，%）按照公式Ap=ni/N×100%计算， 其中ni代表每个可分辨的T-RFLP的峰面积， N代表所有T-RFLP峰面积的总和。种群多样性指数[8]用BIO-DAP软件计算。依据公式C