鳄鱼肉提取物免疫调节的实验研究.docVIP

鳄鱼肉提取物免疫调节的实验研究 汤四荣, 周靖宇, 吴松青 （广东中大南海海洋生物技术工程中心有限公司，广东 广州 510330） 摘要 目的 探讨鳄鱼肉提取物对小鼠免疫功能的调节作用。方法 通过迟发型变态反应、血清溶血素实验、小鼠碳廓清实验、NK细胞活性检测实验，统计各个指标结果。结果 鳄鱼肉提取物免疫调节作用显著，迟发型变态反应、血清溶血素实验和NK细胞活性实验结果均为阳性。结论 提示鳄鱼肉提取物具有较好的免疫调节作用。 关键词：鳄鱼肉提取物 免疫调节 鳄鱼，属脊椎类两栖爬行动物，我国古代称为 鼍龙”，是一种科研价值、生态价值、经济价值较高的野生动物。。 1.1 材料 受试样品：鳄鱼肉酶解液（简称EM），200g新鲜鳄鱼肉通过蛋白酶酶解后，制成300ml鳄鱼肉酶解液，自制；环磷酰胺注射粉针，江苏恒瑞医药股份有限公司生产。KM小鼠，SPF级，体重18-22g，购于广东省医学实验动物中心。鳄鱼肉酶解液按照人体用量3.6ml/天，实验设计5倍、10倍、30倍剂量喂养小鼠。按公斤体重折算，低、中、高剂量分别为0.3ml/kg、/kg、/kg。每组10只小鼠。 1.2 实验方法 1.2.1迟发性变态反应 实验前各组小鼠先灌胃给药，每天1次，连续给药5周，正常对照组、未致敏对照组和环磷酰胺模型对照组小鼠灌胃给予等体积纯净水，给药第4周开始，除正常对照组和未致敏对照组外，其它各组小鼠均腹腔注射环磷酰胺150mg/kg制备免疫抑制小鼠模型，每周1次，连续2周造模。实验开始时，除未致敏对照组外，其余各组用新鲜配制的1% DNCB丙酮麻油（丙酮：麻油 1:1）50μl均匀涂沫在小鼠已经预先去毛的腹部皮肤，第2天再强化一次进行致敏，致敏5日后，用1%DNCB丙酮麻油10uL溶液均匀涂沫在小鼠右耳进行攻击，24小时后处死小鼠，用打孔器打下8mm左右耳片，称重，计算左右耳片重量之差为肿胀度，以之表示DTH程度。进行统计学处理并比较组间差异。 1.2.2对小鼠血清溶血素的影响 实验前各组小鼠先灌胃给药，每天1次，连续给药2周，正常对照组小鼠灌胃给予等体积纯净水。于给药第10天各组小鼠腹腔注射用生理盐水配成2%SRBC悬液（V/V）0.2mlml，依次加入10% SRBC悬液0.5ml、1ml 1:8稀释的豚鼠血清，对照管取1ml生理盐水，加入0.5ml 10%SRBC悬液，1ml 1:10稀释的豚鼠血清，然后37℃恒温水浴中保温10分钟，孵毕即放入冰水中终止反应，用2000rpm/min离心10分钟，取1ml 上清液，加入3ml都氏试剂，同时取10%（v/v）SRBC 0.25mL 加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10分钟后，以对照管作为试剂空白（扣除补体的影响），于540nm波长处比色，测定OD值。另取0.25ml 10% SRBC悬液，用都氏试剂稀释至4ml,，摇匀放置10分钟后，于540nm测定SRBC半数溶血时的OD值。按下式计算样品的半数溶血值（HC50）。 样品HC50 样品的吸光度值 ×稀释倍数 SRBC半数溶血时的吸光值 1.2.3小鼠碳廓清实验 实验前各组小鼠先灌胃给药，每天1次，连续给药4周，正常对照组和模型对照组小鼠灌胃给予同体积的纯净水。同时用注射用环磷酰胺150mg/kg造成小鼠的免疫抑制模型，除正常对照组外，各组小鼠腹腔注射环磷酰胺剂量为150mg/kg，每周1次。于末次给药30min后，尾静脉注射已用生理盐水稀释10倍并经过滤的中华墨汁0.2ml/20g，注射后2min及15min时，用预先1%肝素钠湿润的吸管分别从眶后静脉丛取血20μl溶于2ml 0.1%Na2CO3溶液中摇匀，在波长A640nm下比色，测定光密度OD值。实验结束后处死小鼠，分别称取肝、脾、胸腺重量。按公式计算廓清指数K或校正系数α值。 K lgOD1-lgOD2 /（t2-t1） 注：OD1 ，OD2:不同时间所取血样的光密度；t2-t1:两取血样的时间差。 α k1/3 ×体重/（肝重+脾重） 1.2.4对小鼠NK细胞的影响 小鼠每日灌胃给药1次，连续给药8周，给药第5周开始，采用外周血NK计数。小鼠摘眼采血0.5ml于EDTA-K2抗凝管内混匀，取50μl外周血于流式管，另取50μl外周血加于阴性对照流式管，设定NK1.1抗体单染管及CD3抗体单染管。于各组小鼠外周血中，加入小鼠NK1.1抗体2.5μl及CD3抗体2μl，避光反应15min，加入溶血素1ml，避光反应10min后，1000rpm/min离心5min，弃上清，用2ml PBS洗涤1次，振荡，1000rpm/min离心5min，弃上清；0.5ml PBS重悬后上机。进行统计学处理并比较组间差异。 2 实验结果 2.1对小鼠迟发型变态反应实验结果 由表1可见，鳄鱼肉酶