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鳄鱼肉提取物免疫调节的实验研究.doc
鳄鱼肉提取物免疫调节的实验研究
汤四荣, 周靖宇, 吴松青
(广东中大南海海洋生物技术工程中心有限公司,广东 广州 510330)
摘要
目的 探讨鳄鱼肉提取物对小鼠免疫功能的调节作用。方法 通过迟发型变态反应、血清溶血素实验、小鼠碳廓清实验、NK细胞活性检测实验,统计各个指标结果。结果 鳄鱼肉提取物免疫调节作用显著,迟发型变态反应、血清溶血素实验和NK细胞活性实验结果均为阳性。结论 提示鳄鱼肉提取物具有较好的免疫调节作用。
关键词:鳄鱼肉提取物 免疫调节
鳄鱼,属脊椎类两栖爬行动物,我国古代称为 鼍龙”,是一种科研价值、生态价值、经济价值较高的野生动物。。
1.1 材料
受试样品:鳄鱼肉酶解液(简称EM),200g新鲜鳄鱼肉通过蛋白酶酶解后,制成300ml鳄鱼肉酶解液,自制;环磷酰胺注射粉针,江苏恒瑞医药股份有限公司生产。KM小鼠,SPF级,体重18-22g,购于广东省医学实验动物中心。鳄鱼肉酶解液按照人体用量3.6ml/天,实验设计5倍、10倍、30倍剂量喂养小鼠。按公斤体重折算,低、中、高剂量分别为0.3ml/kg、/kg、/kg。每组10只小鼠。
1.2 实验方法
1.2.1迟发性变态反应 实验前各组小鼠先灌胃给药,每天1次,连续给药5周,正常对照组、未致敏对照组和环磷酰胺模型对照组小鼠灌胃给予等体积纯净水,给药第4周开始,除正常对照组和未致敏对照组外,其它各组小鼠均腹腔注射环磷酰胺150mg/kg制备免疫抑制小鼠模型,每周1次,连续2周造模。实验开始时,除未致敏对照组外,其余各组用新鲜配制的1% DNCB丙酮麻油(丙酮:麻油 1:1)50μl均匀涂沫在小鼠已经预先去毛的腹部皮肤,第2天再强化一次进行致敏,致敏5日后,用1%DNCB丙酮麻油10uL溶液均匀涂沫在小鼠右耳进行攻击,24小时后处死小鼠,用打孔器打下8mm左右耳片,称重,计算左右耳片重量之差为肿胀度,以之表示DTH程度。进行统计学处理并比较组间差异。
1.2.2对小鼠血清溶血素的影响 实验前各组小鼠先灌胃给药,每天1次,连续给药2周,正常对照组小鼠灌胃给予等体积纯净水。于给药第10天各组小鼠腹腔注射用生理盐水配成2%SRBC悬液(V/V)0.2mlml,依次加入10% SRBC悬液0.5ml、1ml 1:8稀释的豚鼠血清,对照管取1ml生理盐水,加入0.5ml 10%SRBC悬液,1ml 1:10稀释的豚鼠血清,然后37℃恒温水浴中保温10分钟,孵毕即放入冰水中终止反应,用2000rpm/min离心10分钟,取1ml 上清液,加入3ml都氏试剂,同时取10%(v/v)SRBC 0.25mL 加都氏试剂至4mL,充分混匀,放置10分钟后,以对照管作为试剂空白(扣除补体的影响),于540nm波长处比色,测定OD值。另取0.25ml 10% SRBC悬液,用都氏试剂稀释至4ml,,摇匀放置10分钟后,于540nm测定SRBC半数溶血时的OD值。按下式计算样品的半数溶血值(HC50)。
样品HC50 样品的吸光度值 ×稀释倍数 SRBC半数溶血时的吸光值
1.2.3小鼠碳廓清实验 实验前各组小鼠先灌胃给药,每天1次,连续给药4周,正常对照组和模型对照组小鼠灌胃给予同体积的纯净水。同时用注射用环磷酰胺150mg/kg造成小鼠的免疫抑制模型,除正常对照组外,各组小鼠腹腔注射环磷酰胺剂量为150mg/kg,每周1次。于末次给药30min后,尾静脉注射已用生理盐水稀释10倍并经过滤的中华墨汁0.2ml/20g,注射后2min及15min时,用预先1%肝素钠湿润的吸管分别从眶后静脉丛取血20μl溶于2ml 0.1%Na2CO3溶液中摇匀,在波长A640nm下比色,测定光密度OD值。实验结束后处死小鼠,分别称取肝、脾、胸腺重量。按公式计算廓清指数K或校正系数α值。
K lgOD1-lgOD2 /(t2-t1)
注:OD1 ,OD2:不同时间所取血样的光密度;t2-t1:两取血样的时间差。
α k1/3 ×体重/(肝重+脾重)
1.2.4对小鼠NK细胞的影响 小鼠每日灌胃给药1次,连续给药8周,给药第5周开始,采用外周血NK计数。小鼠摘眼采血0.5ml于EDTA-K2抗凝管内混匀,取50μl外周血于流式管,另取50μl外周血加于阴性对照流式管,设定NK1.1抗体单染管及CD3抗体单染管。于各组小鼠外周血中,加入小鼠NK1.1抗体2.5μl及CD3抗体2μl,避光反应15min,加入溶血素1ml,避光反应10min后,1000rpm/min离心5min,弃上清,用2ml PBS洗涤1次,振荡,1000rpm/min离心5min,弃上清;0.5ml PBS重悬后上机。进行统计学处理并比较组间差异。
2 实验结果
2.1对小鼠迟发型变态反应实验结果
由表1可见,鳄鱼肉酶
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