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第二章 单细胞藻类培养 第二章 单细胞藻类培养 * 一、单细胞藻类的种类与生物特性 * （一）单细胞藻类培养的种类 * 常用的饵料微藻主要有： * 牟氏角毛藻：虾、蟹、海参、海胆的幼体； * 三角褐指藻：虾、蟹、海参、海胆的幼体、种贝； * 中肋骨条藻：虾、蟹幼体； * 底栖舟形藻：鲍、海参、海胆、埋栖贝类、舔食螺类的附着幼体； * 底栖卵形藻：同上； * 等鞭金藻：贝、虾、蟹、海参、海胆的幼体； * 亚心形四片藻：轮虫、卤虫、种贝及虾的后期幼体； * 海水小球藻：同上； * 钝顶螺旋藻：虾、蟹幼体及配合饲料的添加剂； （二）单细胞藻类的生物学 * 1、盐度： * 大多数单胞藻盐度适应范围很宽。 * 10-40大多数单胞藻能适应。 * 如扁藻、盐藻、小球藻在10-80的盐度中能正常生长。 2、温度 * ①适温 * 绿色巴夫藻10-35℃； * 扁藻7-30 ℃； * 盐藻4-40 ℃。 * 因此大多数单细胞藻类适合在20-25 ℃下培养。 * 一些单胞藻适合在较高温度下生存；如钝顶螺旋藻生存最适为28-34 ℃。 ②低温 * 单胞藻一般忍耐性较强，在一定的低温条件下产生的形态和生理变化是可逆的。 * 利用其在低温环境下呈休眠状态的特点，可较长时间保存单细胞藻类。 * 如在-20 ℃温度下，冰冻20d的三角褐指藻浓缩藻液，解冻后，培养2d即可恢复正常生长。 3、光照 * 5000-10000lx，适合大多数单细胞藻类的培养。 * 某些藻类适合在弱光下培养： * 如中肋骨条藻：5000lx较适宜，而10000lx产生抑制作用）； * 三角褐指藻：3000-5000lx * 某些单细胞藻适合较强的光照： * 等鞭藻：7000-9000lx * 角毛藻:10000-15000lx * 某些单细胞藻类适合在强光下培养： * 如钝顶螺旋藻：30000-35000lx 4、pH * 7.5-8.5是大多数藻类的适宜范围。 * 也有一些藻类适合碱性条件： * 如钝顶螺旋藻8.6-9.5。 5、繁殖 * 主要以二分裂繁殖为主。 * 可将培养过程分为：延缓期、对数（指数）生长期、相对生长下降期、静止期和衰亡期。 二、藻种的分离 * （一）采样 * 个体较大的浮游藻类，可用密浮游生物网在水中捞取。 * 但在水产动物的人工育苗中所需要的饵料微藻，一般个体很小，往往在几微米到十几微米，用浮游生物网无法采集到，需要把水样采回实验室处理。 * 水样采回后，进行显微镜检查，如果发现有需要分离的藻种，而这种藻种的数量较多时，可立即进行分离，若数量少，必须先经过预备培养，待数量增多后再分离。 （二）预备培养 * 1、容器： * 通常采用三角烧瓶。 * 2、培养液： * 各种藻类的培养液存在差异。 * 土壤抽出液Ⅰ:取土壤1kg，加纯水1000ml，煮沸60min，在暗处放置2d，过滤，以滤液600ml加纯水400ml。 * 土壤抽出液Ⅱ：取土壤1kg，加纯水1000ml，再加入NaOH2-3g，煮沸120min，冷却后过滤，滤液直接使用。 * 土壤抽出液Ⅲ：取土壤1kg，加纯水2000ml，煮沸煎浓，把上部泥浆倾入烧瓶中澄清，静置一昼夜后，次日吸取上清液，再煮沸煎浓。第三天在如法煎浓，最后倾入三角烧瓶中，加棉花塞，煎浓，直至得到1000ml的深褐色的土壤抽出液。每次使用后，煮沸灭菌保存。 * 土壤抽出液Ⅳ：取田园土壤1kg，加水2000ml，搅拌均匀，浸泡，用前吸取上清，煮沸消毒后使用。 * 海泥（或土壤）抽出液Ⅴ：用海滩上砂质较少，有机物较多而又不是过分淤黑的上层软泥，清除其中的小树枝和小石块等杂物，以容量计算1份泥加2份水，充分搅拌均匀，静置1-2min，待粗砂，小石沉下，把上层泥浆倾入铝锅内，弃去底部粗砂，小石等杂物。静置24h，吸取上清液使用。 3、管理 3、管理 3、管理 （三）分离方法： * 1、微吸管分离法： * 选直径约5mm的细玻璃管，在酒精喷灯上加热，待熔，快速拉成口径极细的微吸管。 * 微吸管的另一端套接一条长约30cm或8cm的医用乳胶管。 * 在分离操作时长乳胶管的另一端用牙齿咬紧，如用短乳胶管则用手指压紧，用以控制吸取动作。 * 将稀释的水样，置浅凹载玻片上，在显微镜下观察挑取要分离的藻类细胞，吸取时把微吸管对准藻细胞，然后牙齿或手指放松，由于气流的关系，藻细胞被微吸管吸入，接着吸入的水滴放入另一凹玻片上，观察是否是目标单胞藻。 * 然后把分离出的藻细胞移入预先装有培养液的试管中，管口塞棉塞，在适宜光照下培养。每天摇动一次。 2、水滴分离法 * 将微吸管插入水样中约2cm深，提取微吸管，待无水滴自然滴下，把微吸管与载玻片接触，即有一小水滴水样留在载玻片上。 * 按照上述方法，吸取水滴3-4滴，水滴作直线排列，相互间隔一段距离。然后在