CTAB法提甜瓜DNA.docVIP

CTAB法提甜瓜DNA （1）-80℃取甜瓜叶片0.5g）放入预冷的研钵中，加液氮研磨成粉研磨； （2）将粉末转至10ml无菌离心管中，加入60℃预热的2×CTAB缓冲液4ml上下颠倒混匀，60水浴25至60min，每隔5至min颠倒混匀一次； （3）取出离心管冷至室温，加入ml的氯仿/异戊醇（241），颠倒混匀，室温下000r/min离心0min。 （4）取上清ml至另一离心管中，加4ml氯仿/异戊醇（241），颠倒混匀，室温下000r/min离心0min； （5）另一离心管中，加入1/2体积5mol/L NaCl，再加入2倍体积-20℃预冷的95%乙醇，颠倒混匀，-20℃下静置10min； （6）4℃，000r/min离心min，弃上清；（7）加入4℃预冷的70%乙醇ml，颠倒混匀洗涤沉淀，000r/min离心min，弃尽上清，室温下干；（8）将沉淀溶于400μl TE缓冲液中转1.5ml EP管中，加入3μl Rnase A（1mg/ml），37水浴0min； （9）加入200μl的饱和酚和200μl的氯仿/异戊醇（241），混匀室温，13000r/min离心1min； （10）上清300μl于另一1.5ml EP管中加入1/10体积3mol/L NaAc（PH5.2）和2倍体积无水乙醇，颠倒混匀，-80静置过夜4℃，13000 r/min离心1min，弃上清； （11）加1ml 4预冷的70%乙醇，室温静置10min，洗涤沉淀； （12）5000 r/min离心2min，弃尽上清，室温凉干； （13）加入100μlTE溶液μlTE），充分溶解沉淀。 （14）μl，120v，0.7%琼脂糖电泳12min检测DNA质量和浓度，加2ul Maeker15000作对照。 试剂 2×CTAB提取缓冲液：2%CTAB；100mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20mmol/L EDTA，pH 8.0；1.4mol/L NaCl；%β-巯基乙醇（使用前加）； %PVP40。 氯仿/异戊醇24∶1 5mol/L NaCl：蒸馏水配制，高压灭菌。95%乙醇70%乙醇 RNase A：按说明配制成1mg/ml的溶液。 TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl，pH 8.0；1mmol/L EDTA，pH 8.0；双蒸水配制。 3mol/L NaAc：双蒸水配制，用乙酸调pH，高压灭菌。 CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵 ，是一种阳离子去污剂, 溶解细胞膜，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中 0.7mol/L NaCl ,CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。 氯仿/异戊醇（24:1）：氯仿是有机溶剂，去除植物色素，蛋白质和多糖等， 异戊醇可减少蛋白质变性过程中气泡的产生，配合使用两有机溶剂，比用单一有机溶剂去除蛋白质更有效。 Tris-HCl pH8.0 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。 PVP 聚乙烯吡咯烷酮 是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖； 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP 聚乙烯吡咯酮 ,PEG 聚乙二醇 ，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合；蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性 SDS、异硫氰酸胍等 高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化；多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯 1/2体积 ，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 含1.2 M NaCl ，冰浴20min.核酸分离，纯化；盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc pH5.2,3M ，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应