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磷脂酶D的抗逆特性及其活性检测研究 　　摘要：介绍了磷脂酶D（PLD）的研究现状及进展，包括其分类、来源和用途，详述了PLD的抗逆特性和相关作用机理及对PLD活性检测的最新方法，对PLD在科学研究中的发展前景进行了展望。 　　关键词：磷脂酶D（PLD）；抗逆特性；活性检测 　　中图分类号：Q55 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-0998-03 　　1 概述 　　1.1 磷脂酶概述 　　磷脂又称磷酸甘油脂，广义上是指磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺 （PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）和神经鞘磷脂（SM）的复合物，狭义上即为磷脂酰胆碱[1]，是构成生物细胞膜骨架的主要成分，对维持细胞结构的稳定具有重要意义，并且参与细胞代谢和神经细胞的信号传递，同时其水解产物能参与多种生理过程以及环境刺激所引起的细胞反应[2]，在细胞的生命活动中起着重要的作用。磷脂的降解酶有多种，而磷脂酶则是催化降解磷脂第一步反应的关键酶[3]，此过程是在植物细胞膜上普遍存在的信号转导途径。磷脂在磷脂酶作用下水解为脂肪酸、肌醇三磷酸（IP3）、磷脂酸（PA）、二脂酰甘油（DAG）及乙酰胆碱等。根据其水解磷脂的部位不同可以把磷脂酶分为5类，即磷脂酶A1（Phospholipase Al，PLA1）、磷脂酶A2（PhospholipaseA2，PLA2）、磷脂酶B（Phospholipase B，PLB）、磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）和磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）[4，5]。 　　1.2 PLD的分类 　　PLD为磷脂酰胆碱磷脂水解酶，是磷脂酶的一种，用来催化水解磷脂末端的磷酸二酯键形成磷脂酸和亲水性的胆碱等[6]，其催化水解作用广泛存在于萌发种子、衰老器官、逆境胁迫及胞内信号转导中[7]。PLD属于多基因家族，具有多分子异质性，通过对拟南芥PLD基因进行序列相似性和生物特性的分析，将其分成6种类型12个成员，即α（3）、β（2）、γ（3）、δ、ε和 ζ（2）[8，9]，同理将大米的PLD基因分成6种类型17个成员，即α（8）、β（2）、δ（3）、ζ（2）、κ和ψ[10]。目前的研究发现，影响PLD活性的因素很多，包括温度、pH、盐类、溶剂以及底物的聚合状态等，不同来源的PLD有着不同的最适影响条件，比如植物中PLD的最适pH 5～6要比微生物中的最适pH 4～8范围窄[11]。PLD既具有水解特性，又具有转导特性，且其最基本的功能就是维持细胞膜的稳定性[12]，同时PLD具有较广的底物特异性，可以作用于多种底物磷脂及其衍生物，且对构成脂的碱基部分没有绝对的特异性要求[13]，相关研究表明，神经鞘磷脂可能是目前得知的惟一不能被PLD降解的磷脂[14]。 　　1.3 PLD的用途 　　PLD作为降解磷脂类物质的主要酶系，在各种细胞反应中扮演着重要的角色，包括细胞转移、受体的内吞作用、细胞分泌、细胞骨架重组等[15]，同时也在生活生产中得到广泛应用，比如在医药方面。PLD在工业方面可用于油脂精炼、磷脂改性等[16]。总之，PLD已经越来越得到人们的普遍关注。 　　2 PLD的来源 　　有活性的PLD最先是在1947～1948年由Hanahan等[17-19]从胡萝卜根和菠菜叶的提取物中得到的，但是由于其多样性及不稳定性，其活性一直没有得到充分利用，直到1994年Wang等[20]从萌发的蓖麻中通过系列试验得到有活性的PLD基因。迄今为止，从蓖麻、拟南芥、豇豆、甘蓝、烟草、水稻、玉米、番茄、黄瓜、甜瓜等多种植物中克隆到的PLD 基因及其功能已经被广泛研究。虽然PLD普遍存在于动物和植物中，但是由于来源于微生物的PLD种类繁多，多为外分泌表达和单亚基蛋白，容易大量快速制备且成本较低，因而逐渐成为提取磷脂酶的主要来源[5]。常见的产磷脂酶的微生物主要有产碱假单胞菌（Pseudomonas alcaligenes）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens ）、链霉菌（Streptomyces）和米曲霉（Aspergillus oryzae）等[21]，为了改变中国主要采用的微生物菌株由国外购买的现状[22]，研究人员已逐渐筛选培育出了一些高产磷脂酶的菌株。李军红等[23]通过平板初筛和摇瓶复筛的方法获得的高产菌株，经验证鉴定其为蜡状芽孢杆菌（Bacillu scereus），王金梅等[21]则得到的为无色杆菌属（Achromobacter sp.）细菌，同时对其进行脱胶处理，证明其有良好的应用前景。 　　3 PLD在抗逆反应中的作用 　　植物在低温干旱、机械损伤、病原等逆境胁迫下，可通过信号转导迅速