OverlapextensionPCR.docVIP

利用Overlap extension PCR构建突变以及截短体 24.1点突变体设计 利用PCR技术[14]，获取各个点突变体。 1 设计引物 如下设计4个引物, 引物A和B相互互补并含有突变的氨基酸相对应的核苷酸突变。5’端和3’端引物与此基因全长基因的克隆引物相同。引物设计的通常原则参考stratagene公司的QuikChange定点突变试剂盒说明书中的引物设计原则。 2 PCR反应扩增突变体 第一步：分别做两个PCR, 扩增待突变基因的两个半边。 配置如下反应体系： PCR I 模板 1.0μl 10×PCR Buffer 5.0μl dNTP Mixture （10mM） 1.0μl Primer 5’（ 25 M ） 1.0μl Primer B（ 25 M ） 1.0μl Hotstart High Fidelity 酶（Rhche） 0．25μl ddH2O 39.75μl 终体积 50.0μl PCR II 模板 1.0μl 10×PCR Buffer 5.0μl dNTP Mixture （10mM） 1.0μl Primer 5’（ 25 M ） 1.0μl Primer B（ 25 M ） 1.0μl Hotstart High Fidelity 酶（Rhche） 0．25μl ddH2O 40.75μl 终体积