SV40复制位点.docVIP

很多真核表达载体（例如常用的pcDNA3.1）是可以在特定的真核细胞表达系统（COS等）中复制的。这类载体带有SV40 Ori，遇到细胞中的大T抗原后可以启动复制，拷贝数可以达到10^5以上。293T中表达SV40的T抗原，而293细胞中则没有。293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。用Ca3(PO4）2转染效率可高达50%。蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外（分泌的或膜）蛋白的便捷方式。 只有一个复制原点，包括几个必要的元件： ① 四个5′-GAGGC-3′序列，是大T抗原结 合位点。 ② 一个15bp的回文结构，最早解链区域。 ③ 一个只有A-T组成的17bp区域，促进解链。 天然质粒只能转化细菌，它上面带有复制起点ori，以及必要的上下游序列，包括rop蛋白的序列。质粒在细菌染色体外能自主复制，方式有两种，一种不依赖于细菌或质粒合成的蛋白质，质粒拷贝数多，称为松弛型复制；一种依赖于细菌或质粒合成的特定蛋白质，质粒拷贝数较少，称为严谨型复制。（2）质粒载体是经过改造后的质粒，里面如果带有真核病毒的复制起点及其必要的调控序列，并在真核宿主细胞内存在相应的反式作用因子，那么这种载体也可以在真核细胞内复制。反之，如果质粒载体上没有真核病毒的复制起点，则不能在真核细胞内复制。目前许多载体即含有原核复制起点，以便在大肠杆菌内扩增，同时也含有SV40等真核病毒的复制起点，以便于增加目的基因的拷贝数，增强真核表达效果。比如，带SV40复制起点的质粒载体在COS细胞（COS细胞表达反式作用因子SV40大T抗原，可以激活SV40复制起点的转录）内就可以达到10000/细胞的拷贝水平，特别适合于外源真核基因的瞬时表达。 腺病毒可以在293A细胞中进行转录，表达并可进行包装复制出大量高滴度病毒。293T是一种逆转录包装表达细胞，我做过也可进行表达，但还没有具体鉴定表达后的病毒是否可用。293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad 5)DNA的永生化细胞，表达转染的腺病毒5的基因。细胞来源都是人肧肾上皮细胞，293T细胞表达E1A蛋白，SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。293FT细胞能 制造高滴度的慢病毒。293A细胞来源于人肾纤维母细胞，组成性表达E1A 和E1B 蛋白293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。用Ca3(PO4)2转染效率可高达50%。蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外（分泌的或膜）蛋白的便捷方式。?形态特点 上皮细胞?致瘤性 +?产物或抗原 大T抗原?染色体核型 亚三倍体人细胞系。染色体众数为64，30%的细胞有64 条染色体。4.2%的细胞染色体数目更多。多数细胞der(1)t(1;15) (q42;q13), der(19)t(3;19) (q12;q13), der(12)t(8;12) (q22;p13),还有四条标记染色体，有的细胞另有5条标记染色体。der(1)与M8 (or Xq+)常常成对出现。N17 与 N22各有四条。值得注意的是多数细胞有三条X染色体，两条Xq+，一条Xp+。?生长特性 粘附?文献评价 293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化细胞。表达转染的腺病毒5的基因。早期报道认为此细胞含有Ad 5基因组左端和右端，现已清楚仅含有左端序列。此细胞系人腺病毒滴度高。室温不贴壁，37几日后重新贴壁。表达由整合素beta-1 亚基与玻基结合素受体 alpha-v 亚基组成的玻基结合素细胞表面受体.?The Ad5 insert was cloned and sequenced, and it was determined that a colinear seqment from nts 1 to 4344 is integrated into chromosome 19 (19q13.2).传代 293:弃培养基，含0.25% 胰酶, 0.03% EDTA 消化液洗涤，弃去，加1-2ml消化液室温或37消化。加入新鲜培养基，吸出，分到新培养皿中。一传二至一传四。293T:生长快，通常倍增时间不到一天 。每3~4 天1：10至1：20稀释，5% CO2条件下培养。细胞贴壁疏松，可只用EDTA消化，