航天突变株黑曲霉ZM-8产纤维素酶条件研究解析.doc

航天突变株黑曲霉ZM-8产纤维素酶条件研究 05级生物科学： 刘小飞 指导老师： 马旭光 摘 要:对航天突变株黑曲霉ZM-8在玉米秸秆为主要原料的固态培养基上发酵产纤维素酶的条件进行了研究。实验结果表明，黑曲霉ZM-8产纤维素酶的最优培养基配方为：氮源为 NH4 3PO4，含氮量0.6%，含水量300%，玉米秸杆粉与麸皮质量比为4:1，接种量为1:30。最佳培养条件为:培养温度35℃，培养时间为72h，初始pH值为6.5。在优化条件下测得FPU酶、C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶的活力分别为5.25U/mL、0.48U/mL、19.60U/mL和42.86U/mL，约为优化前各酶活的3.0倍、1.8倍、2.5倍和2.1倍。关键词: 黑曲霉ZM-8；FPU；CX；发酵条件；优化1 文献综述 纤维素（fiber）是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30%~50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%[1]；全球每年通过光合作用产生的纤维质高达1.55×109t，而对其利用率仅为11%[2]。目前，我国每年光作物秸杆，5亿t之多[3]，大多都采用燃烧或粗饲料方式的利用。这样即丧失了有机质成分，又容易造成环境污染。因此，提高纤维素的有效利用率具有巨大的发展潜力，而对其有效的利用途径之一就是利用微生物分泌的纤维素酶进行降解。该途径不仅能拓宽饲料来源，提高饲料质量，而且在有利于生态平衡的条件下能缓解粮食短缺及环境污染等问题，可有望发展成为一种集生态效益、社会效益和经济效益一体的清洁产业。 自然界中大量而广泛地存在着能降解纤维素的微生物，它们种类繁多，包括细菌真菌和放线菌等。一组切葡聚糖酶（C1酶）切葡聚糖酶（CX酶）和β-葡萄糖苷酶，C1酶主要作用于天然纤维素，将其转变为水合非结晶纤维素，CX酶接着将水合非结晶纤维素水解成纤维素糊精纤维二糖；β-葡萄糖苷酶作用于纤维二糖生成葡萄糖[]，这四种酶协同作用将天然纤维素降解为葡萄糖。 目前研究最多的产纤维素酶的微生物大多数是真菌，其中木霉属曲霉属青霉属根霉属及漆斑霉属占多数。木霉具有对植物病原真菌的拮抗作用和强烈分解纤维素的能力，广泛存在于土壤等基质中因其酶系中的β-葡萄糖苷酶活力偏低和毒性嫌疑大而使应用受到限制黑曲霉（Aspergillus niger），属半知菌真菌在自然界的分布极为广泛，有多种活性强大的酶系不仅是公认的安全菌株而且产纤维素酶能力较强，且所产的纤维素酶种类较全，其中β-葡萄糖苷酶的活性在所有产纤维素酶的真菌中是最高的，是发酵饲料工业中不可或缺的佳菌种之一，所产生酶制剂具有用量大，应用广泛，安全性好的特点。此外，它对培养基营养要求低，只要培养基中有碳源、氮源以及磷、钾、镁、硫等元素即能良好生长。关于纤维素酶的研究国内外已有大量报道刘颖黑曲霉 9813X8株的选育及其固态发酵条件的优化1：1：4，氮源为1.0%的硫酸铵和1.0%的豆饼，培养基的起始pH值为3.2~3.5，培养时间为48~60h，250ml三角瓶中装培养基5~10g [5]。 郑毅黑曲霉 Aspergillus niger 产β-葡聚糖酶固态发酵优化研究C/N 以麸皮与豆饼粉比例计 为8：1；最佳无机氮源为NH4NO3；大麦对产酶没有明显的诱导作用，，C/N，使产酶水平下降；1：1；最适培养基初始pH为6.0；mL孢子悬液 孢子浓度为415×107/mL ；最适的培养温度为33℃。在以上最适条件下固态培养70h，最高酶活可达141649u/g，比初始设计提高了26% [6]。贺小贤黑曲霉β-葡聚糖酶产酶培养基的研究（Aspergillus niger）β-葡聚糖酶β-葡聚糖、吐温80对β-葡聚糖酶的产生有一定的促进作用；通过正交实验，确定了大麦粉、酵母粉、硫酸铵三者之间的最优组合为大麦粉3%、酵母粉2%和硫酸铵0.2% [7]。 早期就有研究表明，真菌纤维素酶是一类胞外酶，从培养物滤液中就可以很容易得到。它又属于诱导酶，在诱导物存在下才能大量产生。纤维素酶的分泌又受分解代谢产物阻遏 catabolite repression 和反馈抑制 feedback inhibition 两种作用。许多不溶性的纤维素、可溶性的纤维衍生物、一些低聚糖类对某些单糖和二糖均可作为纤维素酶的诱导物。但需要一提的是，纤维二糖、葡萄糖和甘油等低分子可溶性糖在低浓度时有促进作用而较高浓度时便开始抑制。当然，对于不同微生物来说，同一浓度的同一物质也可能有着不同甚至完全相反的作用这方面的研究还甚少。在纤维素酶的生产中，pH值和发酵时间是关键。Mandles等发现，在分批培养物发酵过程中，起初pH最好是自然下降到，再加控制以防止pH降低，消耗纤维素以后自然上升，这样有利于酶的大量分泌。连续培养的情况不