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RNA酶保护试验 ??? RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：1． 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。2． 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。3． 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。4． 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。5． RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6． 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7． 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。??? RPA的缺点是需要同位素标记探针。一、试剂准备1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。2.??? 杂交缓冲液:PIPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。3.??? RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml二、操作步骤1．反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。（1）设计含T7启动子的PCR引物 由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列: T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG 　 引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示： 上游引物 下游引物Ⅱ T7 启动子序列 下游引物Ⅰ ? ? （2）PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。 （3）探针合成标记与纯化 在0.5ml 离心管中加入下列试剂： RNasin （40U/μl） 0.5μl GACU POOL GAC （含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM） 2μl (α-32P(UTP(10μCi/μl) 2.5μl DTT (二硫苏糖醇，0.1M) 1μl 5×转录 buffer 2μl 模板（50ng/μl） 1μl T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl 混合后，短暂离心，37OC保温1hr。 加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。 加入：饱和酚 50μl 氯仿 50μl 酵母tRNA（2μg/μl） 4μl DEPC H2O 100μl 室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75