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项目三 食品中霉菌和酵母计数 1. 掌握测定霉菌和酵母菌的方法和技能 2. 熟练无菌操作技术。 二、实验原理 酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。 　　霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。 霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。 霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等 。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。 霉菌和酵母菌的测定是指食品检样经过处理，在一定条件培养后，所得1g或1ml检样中霉菌和酵母菌菌落数。 三、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：冰箱恒温培养箱均质器恒温振荡器显微镜电子天平无菌锥形瓶无菌广口瓶无菌吸管无菌平皿无菌试管无菌牛皮纸袋、塑料袋培养基和试剂马铃薯葡萄糖琼脂培养基孟加拉红培养基：４　检验程序霉菌和酵母计数的检验程序见图１。５　操作步骤５．１　样品的稀释５．１．１　固体和半固体样品：称取２５ｇ样品至盛有２２５ｍＬ灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为１１０稀释液。或放入盛有２２５ｍＬ无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打２ｍｉｎ，制成１１０的样品匀液。５．１．２　液体样品：以无菌吸管吸取２５ｍＬ样品至盛有２２５ｍＬ无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成１１０的样品匀液。５．１．３　取１ｍＬ１１０稀释液注入含有９ｍＬ无菌水的试管中，另换一支１ｍＬ无菌吸管反复吹吸，此液为１１００稀释液。图１　霉菌和酵母计数的检验程序５．１．４　按５．１．３操作程序，制备１０倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用１次１ｍＬ无菌吸管。５．１．５　根据对样品污染状况的估计，选择２个～３个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行１０倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取１ｍＬ样品匀液于２个无菌平皿内。同时分别取１ｍＬ样品稀释液加入２个无菌平皿作空白对照。５．１．６　及时将１５ｍＬ～２０ｍＬ冷却至４６的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红培养基（可放置于４６±１恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。５．２　培养待琼脂凝固后，将平板倒置，２８±１培养５ｄ，观察并记录。５．３　菌落计数肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ）表示。选取菌落数在１０ＣＦＵ～１５０ＣＦＵ的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。６　结果与报告６．１　计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。６．１．２　若所有平板上菌落数均大于１５０ＣＦＵ，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。６．１．３　若所有平板上菌落数均小于１０ＣＦＵ，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。６．１．４　若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于１乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于１计数。６．２　报告６．２．１　菌落数在１００以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。６．２．２　菌落数大于或等于１００时，前３位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前２位数字，后面用０代替位数来表示结果；也可用１０的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。６．２．３　称重取样以ＣＦＵ／ｇ为单位报告，体积取样以ＣＦＵ／ｍＬ为单位报告，报告或分别报告霉菌和／或酵母数。附　录　犃（规范性附录）培养基和试剂犃．１　马铃薯葡萄糖琼脂犃．１．１　成分马铃薯（去皮切块）３００ｇ葡萄糖２０．０ｇ琼脂２０．０ｇ氯霉素０．１ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．１．２　制法将马铃薯去皮切块，加１０００ｍＬ蒸馏水，煮沸１０ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。用纱布过滤，补加蒸馏水至１０００ｍＬ。加入葡萄糖和