弯曲杆菌多重PCR检测方法的建立.docVIP

弯曲杆菌多重PCR检测方法的建立 摘要：根据弯曲杆菌属细菌细胞致死性膨胀毒素cdtABC操纵子核酸序列，针对cdtA、cdtB、cdtC设计并合成了3对特异性引物，用于建立空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和弯曲杆菌属细菌的多重PCR检测方法。试验证明，建立的多重PCR检测方法能鉴定弯曲杆菌属细菌，并区分出空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌。该方法具有较好的特异性与敏感性，适合在实验室对弯曲杆菌进行检测与鉴定。 关键词：弯曲杆菌；PCR检测方法 中图分类号：S852.612 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）09-0008-02 弯曲杆菌病已经成为危害食品安全的重要食源性人兽共患病，其病原主要为空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌等弯曲杆菌属的细菌。弯曲杆菌为野生、家养动物的正常寄居菌，其中家禽为重要宿主之一，该菌在肠道内有大量细菌，感染的动物通常无明显病症，但可长期向外界排菌，通过排泄物等污染食物和饮水，从而引起人类感染，造成成人和儿童腹泻[1，2]。 利用传统的分离培养与生化鉴定方法对弯曲杆菌进行分类与鉴定比较困难与繁琐，因此有必要开发一种新的鉴定方法来鉴定弯曲杆菌。 PCR等分子生物学检测方法目前已经广泛运用到细菌的分离鉴定之中，其中多重PCR在一个反应中能同时扩增多个片段，可以方便、快捷的鉴定与区分多个菌种。 细胞致死性膨胀毒素是由cdtABC操纵子编码，是弯曲杆菌重要的毒力因子之一[3]，但是序列比对发现弯曲杆菌属中各菌种之间cdtABC操纵子存在着一定的序列差异，本研究根据菌种之间序列的保守区与差异区设计引物，建立了鉴定与区分空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和弯曲杆菌属细菌的多重PCR方法。 1 材料与方法 1.1 菌株 空肠弯曲杆菌标准菌株ATCC 33291、结肠弯曲杆菌标准菌株ATCC 43478均购自中国微生物菌种保藏中心，临床分离菌株由实验室保存。空肠弯曲杆菌与结肠弯曲杆菌均使用mCCDA固体平板或布氏肉汤在42 ℃微需氧条件下培养。 1.2 主要试剂 rTaq酶、dNTPs、DNA maker、细菌基因组提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自宝生物（大连）工程有限公司；改良CCD琼脂（mCCDA）、mCCDA添加剂购自青岛海博生物技术有限公司；布氏肉汤购自北京陆桥技术有限责任公司；微需氧产气袋和厌氧罐购自英国OXOID公司。 1.3 引物设计 参考NCBI上的空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和弯曲杆菌属其他菌株的全基因组序列，根据编码细胞膨胀毒素的cdtABC操纵子上的基因cdtA、cdtB、cdtC在各个弯曲杆菌属细菌的差异，针对cdtA设计特异性扩增空肠弯曲杆菌的引物一对，针对cdtB设计可扩增弯曲杆菌属细菌的通用引物，针对cdtC设计特异性扩增结肠弯曲杆菌的特异性引物。 1.4 模板的制备 用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，并进行适当稀释后作为PCR的模板；或者取固体平板上的单菌落，经超纯水重悬后沸水浴5 min，12 000 r/min离心5 min，冰上放置5 min，取上清作为PCR模板。 1.5 单重PCR扩增与测序 将每对引物分别以空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌标准菌株为模板进行单重PCR扩增，扩增后PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后，切下DNA片段，使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。 1.6 多重PCR 经过梯度摸索dNTPs的浓度、Mg2+的浓度、Tm值，PCR反应条件为：95 ℃ 预变性5 min；然后95 ℃ 45 S，56 ℃ 45 S，72 ℃ 45 S，重复35个循环；最后72 ℃延伸5 min。 2 结果与分析 2.1 引物设计 经过弯曲杆菌属新基因序列比对发现，弯曲杆菌属细菌均含有编码细胞膨胀毒素的cdtABC操纵子，但是各菌种之间cdtABC操纵子的核苷酸序列存在一定的差异。根据保守区和差异区，我们分别设计了特异性扩增空肠弯曲杆菌cdtA基因片段的引物cdtAF、cdtAB，特异性扩增弯曲杆菌属细菌cdtB基因片段的引物cdtBA、cdtBB，特异性扩增结肠弯曲杆菌cdtC基因片段的引物cdtCF、cdtCB，引物序列见表2。 2.2 单重PCR验证引物 以空肠弯曲杆菌基因组为模板，引物cdtAF、cdtAB与引物对dtBF、cdtBB分别扩增出596 bp和467 bp的片段，经测序与空肠弯曲杆菌cdtA与cdtB基因同源性均达99%以上，引物cdtCF、cdtCB未能扩增出条带。以结肠弯曲杆菌基因组为模板，引物对cdtBF、cdtBB与引物对cdtCF、cdtCB分别扩增出467 bp与313 bp的片段，经测序与结肠弯曲杆菌cdtB、cdtC基因均达99%以上，引物对cdtAF、cdtAB未能扩增出条带。 2.3 多重PCR反应