过氧化物酶同工酶电泳分析(经典有用).docVIP

过氧化物酶同工酶电泳分析 实验原理 （1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 （2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 （3）在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。 下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用： （1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。 （2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。 （3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下： 由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。 在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系： V I/S。所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。 当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。 过氧化物酶同工酶的鉴定原理 同工酶是来自同一生物不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构，能够催化相同反应的蛋白质。同工酶作为基因编码的产物，由于模板作用，酶蛋白质中多肽链上的氨基酸顺序（通过RNA）直接反应了DNA链上碱基对的顺序，其变化能代表DNA分子水平上的变化，所以同工酶分析可解释为是从蛋白质分子水平上研究生物群体遗传分化的有效手段。在生物中酶的表达直接受遗传基因的控制，酶经聚丙烯酰胺凝胶的浓缩、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离。从小麦幼苗中提取的粗酶液电泳后，进行酶的特异染色，不同的酶组分显示在凝胶的不同位置而呈现生物特有的同工酶酶谱。 仪器试剂 1． 实验材料 　称取小麦幼苗叶片1 g，放入研钵内，加pH 8.0样品提取液2 mL，于冰水浴中研成匀浆，然后以4 mL提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8 000r/min离心10min，倒出上清液，以等量40％蔗糖及1/5体积溴酚蓝指示剂混和，留作点样用。同上操作，再备一份其根部的样品液。 2． 仪器 （1）垂直板电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线等） （2）稳压稳流直流电泳仪 （3）烧杯：250mL×3 （4）移液器 （5）微量进样器（100μL） （6）大培养皿一套 （7）漏斗 3. 试剂 1 2％琼脂：2g琼脂，100 mL pH 8.9分离胶缓冲液浸泡，用前加热溶化。 2 分离胶缓冲液 pH 8.9 Tris-HCl缓冲液 ：取48 mL 1mol/L HCl，Tris 36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。 3、浓缩胶缓冲液 pH6.7 Tris-HCl缓