獸醫病毒學實習五病毒tcid50之測定.docVIP

獸醫病毒學實習:病毒TCID50之測定 目的: 學習計算病毒力價。 了解病毒力價的定義。 學習連續稀釋法的操作。 學習判定細胞病變效應CPE。 了解不同時間下病毒的感染情形。 定量病毒的方法之一，將病毒液做十倍的連續稀釋後，以多個重複接種於含細胞之96孔盤，經一定時間之培養後，紀錄CPE之情形，並以Read and Muench公式算出TCID50 50% tissue culture infective dose 。其中心法則為全有或全無定律。 器材與藥品: 96孔盤 其中36孔內含少量培養液和 PK-15 豬腎細胞 塑膠試管 內含DMEM 微量分注器 pipette 酒精燈與打火機 燒杯和冰塊 離心管 內裝含假性狂犬病病毒之維持性培養液 簽字筆 75%酒精 倒立顯微鏡 廢液桶 塑膠尖管 DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium 0% FBS DMEM 含假性狂犬病病毒之維持性培養液 方法與步驟: 帶上手套並用酒精消毒後,等待其乾燥後,用酒精將紙巾噴濕置於桌上。 將解凍之含假性狂犬病病毒的離心管置於含冰塊之燒杯中。 3拆開包裝並取出一乾淨的96孔盤。 4將其中36孔內含少量培養液和 PK-15 豬腎細胞的96孔盤和乾淨的96孔 盤並排放在一起，使格數互相對應。 將裝有DMEM的塑膠試管並用微量分注器吸取五次360 μ的DMEM 含0%FBS 分別注入對應格數乾淨96孔盤中第一列的前五格，第六格為陰性對照組，暫不加入360 μ的DMEM，以避免汙染。 6.將DMEM塑膠試管過火後關上。取一黃色微量分注器pipette 要注意刻度的大小 ，將刻度轉到040即40 μ，並以此微量分注器pipette吸取40 μ含假性狂犬病病毒的維持性培養液注入含360 μ DMEM的第一格中，並且反覆沖提10次以上，以使混合均勻。 更換塑膠尖管後，以微量分注器吸取第一格中的混合培養液40 μ注入到含360 μl DMEM第二格中，並反覆沖提十次,使其混合均勻。更換塑膠尖管後，以微量分注器吸取第二格中的混合培養液40 μ注入到含360 μl DMEM第三格中，並反覆沖提十次，使其混合均勻。 1更換塑膠尖管後，以微量分注器吸取第三格中的混合培養液40 μ注入到含360 μDMEM第四格中,並反覆沖提十次，使其混合均勻。 1更換塑膠尖管後，以微量分注器吸取第四格中的混合培養液40 μ注入到含360 μDMEM第五格中，並反覆沖提十次，使其混合均勻。 1以簽字筆將每一格的病毒濃度標上。 1在含有PK-15豬腎細胞的96孔盤蓋子上以簽字筆畫線框起每一病毒液濃度所對應的那一排細胞。14.將黃色微量分注器刻度轉到050，以微量分注器吸取第一格病毒液0 μl 濃度為10 注入其所對應的第一排細胞,因有一排6格，故ㄧ濃度要重複抽取6次。15.重複上述步驟將每一濃度的病毒液分別注入其所對應的那一排細胞。 1第六排為控制組，故將裝有DMEM的塑膠試管過火後打開，以微量分注器吸取6次50 μ的DMEM 分別注入第6排的每一格子中。 1將含有PK-15的豬腎細胞與不同濃度病毒液的96孔盤靜置24小時。 1以倒立顯微鏡觀察96孔盤中含豬腎細胞和病毒液每一格的感染現象，若出現CPE現象即確認感染，記錄之並計算病毒力價。 計算採Read-Muench Method方法1. 先算出距離值 感染力高於50%- 50% 感染力高於50%-感染力低於50% 2. 計算TCID50之終點，取高於50%之稀釋倍數之log值加上距離值，即為TCID50之終點 10 10 10 10 10 Control 1 ＋ ＋ － － － － 2 ＋ ＋ ＋ － － － 3 ＋ ＋ ＋ － － － 4 ＋ － ＋ － － － 5 ＋ ＋ － ＋ － － 6 ＋ ＋ ＋ － － － 感染比率: 10:100% 10:100% 10:66.7% 10:16.7% 10:0% 66.7%-50% / 66.7%-16.7% 0.334 -3＋ 0.334 x -1 -3.334 病毒力價為: 10 TCID/50 μL 24小時 。 13