彗星实验(英语版).docVIP

彗星”分析法在放射生物学中的应用来源：广东医学杂志 点击数：196 更新时间：2007-4-25 文章录入：Admin? ? “彗星”分析法在放射生物学中的应用? ? 贺玉香 综述? ?夏云飞 审校? ? 中山大学肿瘤防治中心放疗科(广州 510060)? ? “彗星”分析法（comet assay）又叫单细胞凝胶电泳（single cell gel eletrophoresis, SCGE）或微凝胶电泳，是一种比较理想的单细胞水平检测哺乳类有核细胞DNA损伤的新技术。由Ostling等［1］1984年首次提出，后经Singh等［2］逐渐改进。现主要分为中性SCGE和碱性SCGE。其原理如下：去污剂或高盐裂解溶液破坏细胞膜，使得95%以上的蛋白质及细胞内其他成分渗出膜进入溶解液，DNA由于相对分子质量大而留在原位。电泳时小的DNA断片在电场作用下移出细胞核。经溴乙啶染色后在紫外线(uv)照射下发出荧光，每个受损的细胞均呈现 “彗星”外观，明亮的头部为细胞核，一系列的DNA断片组成“彗尾”。未受损的细胞只有“彗核”而无“彗尾”。DNA断片迁移的距离与DNA断片分子质量和电荷数相关，DNA断片越多、越小，“彗尾”越长，又因荧光染料与DNA的结合是特异性的，因此，通过测定 “彗星”尾部长度和荧光强度可推测DNA链断裂情况。如为中性裂解液加上50 的处理只能破坏DNA超螺旋结构，而DNA双螺旋结构保存完好，只有小的双链片段在电场作用下移出细胞核，形成 “彗星”尾部，故主要用于DNA双链断裂的检测。而碱性SCGE中用碱性裂解液（pH123）处理细胞，不但使细胞内蛋白成分更彻底地分离，也有利于DNA双螺旋破坏和单链片段移行，故用于检测DNA单链断裂。? ? 此法的突出优点是灵敏度高。它可以测出每1657×10－17 kg中01个DNA的断裂，甚至检出自然光照体外淋巴细胞1 h引起的DNA损伤［3］。故可研究低剂量下的生物效应。其次，它能对单个细胞进行分析，故适用于体内、体外、不同实验室、不同细胞的研究。此外，此法还具有所需细胞样本数少（10 000 个）、无需同位素标记、快速、简便、经济等优点。但是，此方法也存在一定的局限性。最为突出的是用于测量DNA损伤的几个重要参数不可能标准化［4］。目前测量的指标较多，主要有尾长、尾力矩、尾部DNA百分数、尾惯量等，但每一指标的应用均有它的局限性。尾力矩为现常用的较灵敏指标。另一个问题是 “彗星”图像有可能被饱和。此外，SCGE实验结果还受电泳的电压及时间、碱化处理条件及细胞数等多个因素的影响。因此，在严格控制影响因素后，才能使SCGE在检测中发挥优势。近年该实验已广泛用于放射生物学、遗传毒理、生物监测及肿瘤发病机制等多个领域。笔者着重介绍该技术在放射生物学领域的应用。? ? 1应用? ? 11检测各种辐射所致的DNA损伤单链断裂是DNA辐射损伤的最敏感指标，双链断裂是引起生物学效应的主要原因。不同品质的射线所致的损伤类型不同，如高LET射线引起双链断裂为主，低LET射线以致单链断裂为主，而uv以引起碱基损伤为主。随着射线LET的升高，单链断裂减少，双链断裂增多。故可以通过检测DNA损伤的不同类型来评价射线的生物学效应。? ? 111DNA单、双链断裂碱性SCGE是检测DNA单链断裂最灵敏的指标［5］，通常用SCGE测到的DNA断裂与剂量呈线性关系。取射线处理后的标本在 ４*! 条件下操作，直到荧光显微镜观察。其目的是在低温条件下抑制DNA修复的酶活性，使断裂的DNA能得以保留至最后分析。根据“彗星”图像出现的情况就能准确测到某种射线是否造成DNA断裂及断裂情况。在中性环境下裂解、电泳后所测到的“彗星”图像则可代表DNA双链断裂情况，因为双链断裂比单链断裂出现的机率少25～40倍，故所用射线的剂量应大，并且要用严格的裂解液，检出双链断裂的最少剂量是5 Gy。Olive等［6］证实了5～300 Gy的范围内“彗星”法检测到的双链断裂也与剂量呈线性反应关系。? ? 112检测DNA-DNA链间交联、链内交联及DNA-蛋白质交联（DPC）辐射损伤致DNA链间交联不如化学损伤多，但也能发生。其检测方法有两种：一是延长电泳时间，使对照组出现“彗星”影像，而处理组DNA迁移距离反而短于对照组。此法可检出多种交联形式。其二，处理组与对照组都加一标准的断裂剂，这样交联的存在就会减少后者所致的DNA断片释放，与对照组相比“彗星”尾部减少的长度等指标与交联的量成正比。但是如所用射线引起的DNA交联少而断裂多，则用此法不太实际。因为射线所致的DNA 链断裂会产生一个很高的“彗星”背景而不利于判断［4］。? ? 有实验研究发现小牛胸腺脱氧核糖核蛋白（DNP）在uv或γ射线照射以后，其中