免疫固定电泳操作SOP.docVIP

免疫固定电泳操作规程 一、项目名称 免疫固定电泳（HYDRAGEL IMMUNOFIXATION） 二、检验方法名称 琼脂糖凝胶免疫固定电泳 三、方法学原理 血清蛋白电泳中出现的异常条带主要存在于β-球蛋白和γ-球蛋白区域，通常疑为单克隆蛋白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异常条带，可运用免疫固定技术。免疫固定电泳是一种简单的技术，电泳后的蛋白质与相应抗体形成复合物和被固定在相应的位置上，通过下列四个步骤： 1、蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分离。 2、电泳后已分离的蛋白质被固定并产生免疫沉淀：应用固定剂和抗血清加于凝胶表面的泳道上，并让固定剂和抗血清在凝胶内渗透扩散。 3、使用吸水纸和清洗将未沉淀的蛋白质去除，已被沉淀的蛋白质贮留在凝胶内。 4、将蛋白质染色，并将这些免疫沉淀区带的位置与蛋白质经电泳后观察到的异常蛋白区带进行比较。 为了精确识别单克隆区带，样品同时在六条泳道上进行测试。经电泳后，ELP作为参考泳道以显示电泳后的蛋白质。其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。通过它（们）与抗血清，γ(IgG)、α(IgA)、μ(IgM)重链和κ、λ轻链（游离和非游离）反应与否进行鉴别。该技术简单、快速、图象清晰，易于解释结果。 四、方法学溯源 自1930年由Tiselius发现了移界电泳（moving boundary eectrophoresis），而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性是鉴定某一蛋白成分最好的方法，免疫固定电泳技术是目前应用最广泛的方法之一。 五、仪器 （一） 型号 ：SEBIA HYDRASYS (PN1210) （二） 分析和计算参数： 1、处理量：约18个样本/小时 2、所需样本量：10ul 3、检验时间：约55分钟 4、重复性：有良好的批内和批间重复性 5、电泳参数：电压0－300V（可选至3000V） 电流0－500mA 功率0－100W 六、试剂及配套品 （一）试剂 1、HYDRAGEL 1 IF试剂盒 HYDRAGEL 2 IF试剂盒 HYDRAGEL 4 IF试剂盒 HYDRAGEL 9 IF试剂盒 （1） 商标：SEBIA （2） 包装规格：10测试/20测试/40测试/90测试 （3） 货号：PN4301/ PN4302/ PN4304/PN4309 2、脱色液 （1） 商标：SEBIA （2） 包装规格：Pack for 10×100ml （3） 货号：PN4540 （4）成分：柠檬酸 3、洗涤液 （1） 商标：SEBIA （2） 包装规格：Pack for 10×80ml （3） 货号：PN4541 （4） 成分：叠氮钠 4、稀释剂 （1） 商标：SEBIA （2） 包装规格：Pack for 1×5ml （3） 货号：PN4587 （二） 配套品 IF试剂抗体 （1） 商标：SEBIA （2）包装规格：Pack for 5×1ml （4） 货号：PN4315 七、操作步骤 （一）开机，启动电泳仪。 （二）将1只（用于1，2IF），2只（用于4IF）或3只(用于9IF)点样梳置于整表面，有数字的一端向上，在2分钟内完成每块加样梳的加样，每孔加10ul样品，然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内5分钟。 电泳/免疫固定泳道 孔号 ELP GAM K L Kf Lf Hydrasys 1 IF 1 2 3 4 5 6 Hydrasys 2/4 IF 1或3号样本 2 3 4 5 6 7 2或4号样本 9 10 11 12 13 14 Hydrasys 9 IF 1,4或7号样本 1 2 3 4 5 6 2,5或8号样本 7 8 9 10 11 12 3,6或9号样本 13 14 15 16 17 18 （三）选择相应的“IF”电泳程序 （四）从包装袋内取出缓冲条，将其固定在电极支架背侧的钉上，再取出凝胶，用薄滤纸快速轻轻地吸去凝胶表面多余的液体，在温控板表面下1/3处加200ul蒸馏水或去离子水，将凝胶片底边紧靠框架底边，边缘对齐边线，略弯曲凝胶片慢慢放平，注意凝胶片下面勿出现气泡。 （五）自然放下支架，从湿盒中取出加样梳并去除齿梳下的保护支架，1、2IF的点样梳置于支架6号位，4IF的2只点样梳则分别置于3号和9号，9IF的3只点样梳则分别置于2，6号和10号，注意点样梳上的数字必须面对操作者，关上电泳舱盖，按下键盘左侧的绿色箭头“START”键，电泳开始，确保仪器右侧的空气通道不被堵塞。 （六）电泳仪自动发出蜂鸣声，提示电泳结束，进行免疫固定操作。打开电泳盖，将加样梳和缓冲条丢弃，移走两支架，用湿纸巾擦拭电极丝，将抗体加样条装入抗体加样架上，按如下要求将动物血