一种用于工艺研究的混合模型的应用.pptxVIP

王金辉 一种基于QbD/PAT思想的 工艺开发混合模型 目 录 文献来源 关键概念 QbD： quality by design（质量源于设计） PAT： Process Analytical Technology（过程分析技术） DoE： design of experiments（试验设计） Neural networks：神经网络 Hybrid model：混合模型 Dynamic modeling：动态建模 背景介绍 FDA推荐使用PAT实现在线检测以及从中间产品到最终产品的闭环控制。 QbD是进行产品开发和工艺改进的一个工具，它基于对产品的深刻理解。哪些工艺参数为CPPs，哪些质量属性为CQAs，参数与参数之间是什么关系，参数与质量之间又有什么关系。参数的范围是多大，为什么要这么大的范围。以上这些问题都可以通过DoE来解决。 通常使用的DoE方法如RSM设计（曲面设计）等，其结果分析为纯数据统计。本论文研究另一种可替代的方法，半参数混合模型，其可将已知的知识与数据统计相结合，我们将使用此模型研究大肠杆菌的培养及其产物重组蛋白生产，并使用QbD和PAT进行评估。 实验方法 一 发酵 1. 以下条件完全一致 发酵罐（4个）、通气率、接种浓度、压力、培养体积、溶氧（调节搅拌速度）。 2. 发酵共分为三个阶段：培养阶段、流加培养阶段、IPTG诱导产品表达阶段。 3. 温度通过夹套控制，pH值通过补碱调节 4. 培养阶段：当pH值开始升高搅拌速度降低时表示C源耗尽，培养阶段结束，流加培养阶段开始。 一 发酵 5. 流加培养阶段：流加培养通过重量进行控制，一直到此阶段，4个发酵罐的所有培养条件均完全一致。 6. 诱导阶段：重组蛋白表达发生在IPTG诱导之后（即第三阶段）。诱导表达的最佳条件通过DoE设计进行确认，因素有温度、pH值、加料速度、生物浓度。 7. 试验在四个不同的发酵罐内进行，培养时间从22-30h不等，但是取样时间均在22h进行，也是DoE试验的终点。 实验方法 二 检测 1. 采用在线监测的方法检测 温度、pH、溶氧、搅拌速度、通气速度、罐压等，15s采集一次数据 2. 为提高计算效率，混合模型采用30min一次的数据进行计算。 3.生物浓度、代谢产物、产品分别采用光密度（OD）、SDS、RP-HPLC等方法进行检测。手动取样。 实验方法 三 工艺开发-DoE 1. DoE 1 ：a four-factor Doehlert design (DoE 1 in Table 1，23个试验) DoE1结果显示，最优工艺参数在所选择水平之外，因此进行第二第三次的DoE 2. DoE 2 ：降低温度和生物浓度 因素 生物浓度 温度 pH 加料速度 水平数 5 7 5 3 因素 温度 加料速度 水平数 5 3 实验方法 三 工艺开发-DoE 3. DoE 3 ：升高pH值和加料速度 4. 然而通过以上三个试验并没有让产品产率产生明显的提高 因素 pH 加料速度 水平数 3 5 实验方法 三 工艺开发-混合工艺模型（基于理想化模型） 1. 2. 3. 4. 5. X代表生物浓度，D代表稀释速率 补料速率 P/X代表单位生产率，VP/X产生速率 产品动态产率 补料与生物浓度关系 实验方法 三 工艺开发-混合工艺模型 6. 以上公式描述了碱的补加与生物浓度和产品产率等的关系，这些是不能进行直接检测的，其为以下模型的一部分。 7. 神经网络：对于非线性函数，使用人工神经网络架构是比较合适的，即动态串联混合建模结构。 8. 本模型近似于三层神经网络结构，输入输出层之间的节点具有线性关系，而隐含层为切向双曲传递函数。即： （w1,w2为网络节点的连接权重，b1，b2为偏差，x1为输入矢量） 实验方法 建模数据库 实验方法 实验方法 建模数据库 实验方法 建模数据库 实验方法 建模数据库 三 工艺开发-混合工艺模型 9. 参数辨识（训练） c为模型最小加权残差，cexp为试验数据点，分子为试验结果的方差。 使用了梯度下降最小值算法 lsqnonlin (Matlab Toolbox工具)，因为采用的是梯度下降法，所以辨识结果能很精确地逼近真实数据。 实验方法 实验方法 参数识别点汇总 检测值和预测值有很好的重合性，碱的消耗可以作为细胞生长与重组蛋白产生的动态指标。 模型结果与讨论 检测值和预测值细胞浓度较好重合，而重组蛋白重合性不好，可能与醋酸的干预有关系。 模型结果与讨论 醋酸、搅拌、碱是影响试验结果的显著因素，然而三者均无法独自作为模型的因素进行输入 模型结果与讨论 工艺结果与讨论 最佳参数位于DOE范围之外，混合模型方法可以预测结果而DOE不可以 工艺结果与讨论 由F图可知，随着细胞质内物