第十三章生化药物制造工艺多肽与蛋白质类药物.pptVIP

早期的多肽合成是在溶液中进行的，称为液相合成法。现在多采用固相合成法，与液相法相比，固相法大大地降低了每步产品提纯的难度。 近几十年来，固相法合成多肽以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的优势而成为多肽与蛋白质合成中的一个常用技术。 应该指出的是人们还只能合成一些较短的肽链，对于合成蛋白质还有诸多的困难，而在生物体内，核糖体上合成肽链的速度和产率都是惊人的。 那么，是否能从生物体合成蛋白质的原理上得到一些启发，应用在多肽合成上，这是一个令人感兴趣的问题，也许是今后多肽合成的发展方向。 对于多肽合成一般需要以下几个主要步骤： 氨基保护和羧基活化；羧基保护和氨基活化；接肽和除去保护基团。 1、基团保护 要实现控制多肽合成，必须做到事先把不应与接肽反应试剂发生作用的官能团，如N－末端氨基酸残基的自由－NH2 、C－末端氨基酸残基的自由－COOH以及侧链上的一些活泼基团，特别是－SH等，加以封闭或保护。待肽链形成之后，再将保护基除去。 作为保护基，必须既能在接肽时起到保护作用，而在接肽以后，又能很容易地除去，且不致引起肽链的断裂。 常用的氨基保护剂有苄氧羰基（需要用较强的酸解条件才能脱除）、叔丁氧羰基（Boc，可用三氟乙酸TFA脱除）和9－芴甲氧羰基（Fmoc，可用哌啶－ CH2Cl2，或哌啶－DMF脱除），其中Fmoc最常用。 羧基的保护通常是用无水乙醇或甲醇在盐酸存在下进行酯化，使羧基接上烷基。除去保护基可在常温下用氢氧化钠皂化法。 其他功能基团，例如组氨酸的咪唑基、丝氨酸的羟基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基等，都可用苄基（Bz）保护，用钠氨法除去。 谷氨酸和天门冬氨酸的β－及γ－羧基可用β－及γ－苯甲酯保护，用催化氢化法除去。精氨酸的胍基用对甲基磺酰基（Tos－）保护。 2、肽的液相合成法 接肽反应除用缩合剂合成外，还可以用分别活化参与形成肽链的氨基和羧基的方法来完成。因活化氨基的反应激烈，而且常常产生消旋化，所以，总是采用羧基活化的方法，也就是说，合成肽的常规方法是从C－端向N－端进行。 肽的合成法可分为阶梯伸长法和片断缩合法。 阶梯伸长法是合成比较小的肽或肽段常采用的方法： 片断缩合法是由小肽缩合成大肽的方法，为了避免消旋，常用叠氮法接肽。 3、肽的固相合成法 1963年，R．B．Merrifield创立了将氨基酸的C－末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸、延长肽链 合成蛋白质的固相合成法 在固相法中，每步反应只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的，为自动化合成肽奠定基础。 今天，固相法得到了很大发展。除了Merrifield所建立的用Boc（叔丁氧羰基）保护α－氨基的Boc固相合成法之外，又发展了α－氨基用Fmoc（9－芴甲氧羰基）保护的Fmoc固相合成法。 在Boc合成法中，反复地用酸来脱保护。这种处理带来了一些问题。如在肽与树脂的接头处，当每次用50％TFA（三氟乙酸 ）脱Boc基时。有约1．4％的肽从树脂上脱落，此外，酸催化会引起侧链的一些副反应。 Boc合成法尤其不适于合成含有色氨酸等对酸不稳定的肽类。 1978年，报道的Fmoc（9－芴甲氧羰基）基团作为α－氨基保护基，成功地进行了多肽的Fmoc固相合成。 Fmoc法与Boc法的根本区别在于采用了碱可脱除的Fmoc为α－氮基的保护基。 4、合成肽链的纯化 多肽合成以后，由于在介质中存在着副产物，因此仍然有分离、纯化的问题，但这比在天然原料中进行纯化要方便得多。蛋白质分离纯化的一般技术手段都可以酌情配合使用，如结晶法、超滤法、高效液相色谱、亲和层析等。 （三）基因工程法 自20世纪70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。 基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地生产许多以往从自然界很难或不能大量获取的蛋白质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。 基因工程蛋白质药物的生产是一项十分复杂的系统工程。 可分为上游和下游两个阶段。 上游阶段是研究开发必不可少的基础，它主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞）。 下游阶段是从工程菌（细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。 下游阶段主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控