油红O染色法及Masson染色法.docVIP

油红O染色及Masson染色 油红O染色?? 1.?染色液的配制?? 材料：油红染料?棕色可密封瓶?异丙醇?研钵?漏斗?定性滤纸?? 称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至100ml，棕色瓶密封（或锡箔纸包裹避光）4℃保存，为储存液，可长期保存。用时取6ml加三蒸水4ml混匀，定性滤纸过滤，稀释后数小时内用完。??2.?10%中性甲醛的配制?? 材料：中性甲醛（多聚甲醛）?密封瓶?? 称取1g中性甲醛粉末，加入10ml的三蒸水中，密封，在60度水浴中过夜才能溶解。配好的溶液1个星期内有效，最好4度保存。?? 3.染色对象?间充质细胞脂肪诱导后不同时间段。?? 4.培养载体?3毫升培养瓶。如果培养载体为塑料制品，hoechst33342染核的话，塑料板自发荧光也为蓝色，必须考虑。??5.染色步骤：?? 5.1?先小心轻缓倒去培养夜。?? 5.2?用pbs轻缓漂洗（不洗没问题）。? 5.3?加10%中性甲醛固定30min（实际固定时间过夜都没问题。固定液用95%酒精也可）。固定的是细胞膜。?? 5.4?稀释油红储存液，油红：去离子水＝3:2，滤纸过滤，室温放置10min（除去一些杂质，染色结果更清晰）。?? 5.5?染色10min左右，加的体积覆盖住板底即可，如6孔加1.5ml，24孔加0.5-1ml（实际染色时间1小时都可以）。?? 5.6?脱色，用75%酒精/60%异丙醇漂洗，除去多余的染料（实际用其他平衡液洗也没问题，背景并不会残留多少）。?? 5.7?复染，淡苏木染色1/5分钟，pbs漂洗（这一步不做也可，看试验需要，并且苏木素会把胞浆染红，如要显示核，?hoechst33342也可以，浓度5微克/毫升染10分钟即可把核染上）。??5.8甘油明胶封片（封片后可长期保存）。??5.9?显微镜观察。??注意事项：? 脂肪油红染色，有的是动物/人体脂肪组织切片，或细胞爬片。各有操作差异。以下是各论坛方法小结，不全。?? 1.完全成熟饱满的脂肪细胞，容易破裂，脂滴泄漏，所以压片，切片都要考虑到这个问题。?2.细胞爬片细胞溶液脱落，特别是脂滴大的。操作务要轻柔。不要把细胞冲掉。??3.如果做脂肪组织冰冻切片，冰冻温度比普通要低，切片厚度加厚。 Masson三色染色? 主要用途：?主要用于胶原纤维和肌纤维的鉴别染色。? 检验原理:? 由mallory三色染色改造，利用两种或三种阴离子染料混合一起或先后作用完成染色，与阴离子染料分子大小和组织的渗透性有关。根据组织不同的渗透性能，选择分子大小不同的阴离子的染料进行染色，便可把不同组织成份显示出来。? 一、实验试剂? 1.?Regaud?氏苏木精：苏木精1g，95%酒精10ml，甘油10ml，蒸馏水80ml。将苏木精加入蒸馏水内加温溶解，冷却后加入酒精和甘油，放数日后即可应用； ?2.?Masson丽春红酸性复红液：?丽春红0.7g，酸性复红0.3g，蒸馏水99ml，冰醋酸1ml；? 3.?0.2%冰醋酸水溶液：?冰醋酸0.2?ml，蒸馏水100?ml；? 4.?1%磷钼酸水溶液：磷钼酸1g，蒸馏水100?ml；? 5.?苯胺蓝水溶液：苯胺蓝2g，蒸馏水98?ml，冰醋酸2?ml；?6.?1%光绿水溶液：光绿?1g，蒸馏水100?ml。 ?二、操作步骤? 1.?石蜡切片脱蜡至水；? 2.?铬化处理或去汞盐沉淀 甲醛固定的组织此步可略 ； ?3.?依次自来水和蒸馏水洗；? 4.?用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min； ?5.?充分水洗，如过染可盐酸酒精分化；? 6.?蒸馏水洗；? 7.?用Masson?丽春红酸性复红液5-10min； ?8.?以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻； ?9.?1%磷钼酸水溶液分化3-5min；? 10.?不经水洗，直接用苯胺蓝或光绿液染5min；? 11.?以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；? 12.?95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。? 结果：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色 如光绿液染色为绿色 ，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色。 ?三、体会与说明? 1.?控制好染色步骤；? 2.?组织固定起着很重要的作用，根据不同的固定液可延长或缩短染色时间；?3.?0.2%冰醋酸水溶液洗，可使色调清晰鲜艳；? 4.?磷钼酸水溶液对丽春红、酸性复红有分化作用，分化时镜下控制，?肌纤维和纤维素呈红色，胶原纤维呈淡粉红色即可。 检验结果：? 胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色，肌纤维、纤维素和红细胞染红色、胞核染蓝黑色。 ?注意事项：? 1.weigert铁苏木素分A、B两液，应与临用前将两液等分混合，而不宜预先混合，否则容易氧化沉淀而逐渐失去染色能力。? 2.组织用bouin氏液或zenker氏液固定为佳，如已