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分子克隆基本操作 PCR（聚合酶链反应）扩增体系 实验成分 加入量（ul） 终体积 模板DNA 0.1 dNTP 0.4 上游引物（P1） 0.5 下游引物（P2） 0.5 20 ul 10×Taq Buffer 2.0 TaqDNA聚合酶 0.1 ddH2O 16.4 PCR全过程是由变性、模板与引物结合（复性）及引物延伸3个步骤组成的不断重复过程： 反应条件 PCR反应　　　变性 退火 延伸 循环周期 １ 940C预变性5min 1 ２ 940C 1 min 50~570C1 min 720C 1 min 25~35 ３ 720C 5min 反应结束后，样品可与40C暂存 PCR产物的凝胶电泳检测 1%琼脂糖凝胶配制： 配胶：将卡子放于制胶器孔中； 称取0.3g琼脂糖溶于30ml 1×TAE之中置于微波炉中煮沸三次； 倒胶：待温度降低600C左右时（手感容器能耐受），在凝胶中加入EB 至终浓度0.5ug/ml（30ml凝胶1.5ulEB）,摇匀后缓慢倒入制胶器中。避免产生气泡，尤其注意梳子周围不能有气泡，若有气泡可用吸管吸去。 凝胶条件：在室温中放置30~45min.。 拔梳子：小心垂直拔出梳子，保持点样孔完整。 加样： 凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面应高出凝胶表面1mm。将PCR产物与6×加样缓冲液，混合均匀加至加样孔中。同时，根据待分离片段的大小选择不同的DNA分子量标准作对照。加样孔处于电泳槽的阴极端。（加样是勿碰坏凝胶孔壁，否则DNA带型不整齐。） 电泳： 接通电源，开启电源开关，观察正负两极是否有气泡出现，且负极比正极气泡多，设置电泳电压及电泳时间（电泳时间视具体样品而定，一般15~30min）。 4. 拍照： 胶置于凝胶成像分析仪中，根据图片用途调整焦距及灯光。 DNA切胶回收 切胶: 于紫外灯下确定欲回收的 DNA片段，取干净EP管称重m1标记，用手术刀切下含有目的DNA片段的凝胶块，置于EP管中。（观察和切胶含目的DNA片段的凝胶时，紫外灯照射时间不宜过长，以减少紫外线对DNA的损伤、剪切或引起基因的突变。） 称总重m2，则胶重为m2-m1, 按胶重量加入Binding Buffer。 3. 将EP管置于55-65℃水中融化7min, ,每2-3min震荡一次。 4. 将混合液体加入HiBind管柱中室温离心10000*g 1min 弃取收集液。 5. 加入300ulBinding Buffer洗柱离心10000*g 1min。 6. 加入700ulSPW Wash Buffer, 室温放置2-3min, 离心10000*g 1min 弃取收集液。 7. 重复⑥ 8. 空柱离心10000*g 1min,充分干燥柱上的DNA,弃取收集液。 9. 将柱子移入空1.5mlEP管中,加入20ulDNA Elution Buffer, 离心10000*g 1min。 四、建立酶切体系 目的片段酶切体系 实验成分 加入量（ul） 胶回收产物 5.0 酶切酶1 0.5 酶切酶2 0.5 Buffer 2.0 ddH2O 2.0 克隆性基因载体的酶切体系 实验成分 加入量（ul） 克隆性基因载体（质粒） 2.0 酶切酶1 0.4 酶切酶2 0.4 Buffer 2.0 ddH2O 5.2 凝胶电泳检测及胶回收 同二、三两步 六、目的基因与克隆载体的体外重组（连接） 实验成分 加入量（ul） 目的基因胶回收产物 5~7 克隆性基因载体胶回收产物 1 水浴450C 5min 冰水浴00C 3min 静置 T4 Ligase 1 10* T4 Ligase Buffer 1 160C过夜 七、重组克隆基因引入受体细胞（转化） ⑴、-70℃取出TOP10 50uL（置1.5ml EP管中），立即冰水浴10min。 ⑵、加入5uL上述连接产物，轻轻混匀（在超净台中完成）。 ⑶、放入0℃冰水浴30min（放于4℃冰箱）。 ⑷、而后放入水浴锅中42℃热休克90秒（严格控制时间）,转入0℃冰水浴3min。⑸、加入800ul LB培养液，置摇床37℃孵育45min-1h。 ⑹、将其取出，5000rpm离心5min，弃上清留约100uL残液均匀涂于LB平板上 LB平板预先烘干 置37℃培养箱中培养12-16h. 八、含目的基因重组体的筛选（挑单克隆菌落） 取出上述LB平板置于超净台中，并同时取试管架,EP管架各一只、LB培养液一瓶（个人专用）、氨苄青霉素（AMP﹢）。 ⑴、点燃酒精灯，取干净试管（数目依据欲挑菌数）。 ⑵、每管加入5mL LB培养液（无菌操作）。 ⑶、分别加入5uL氨苄青霉素（AMP﹢）。 ⑷、挑单个菌体，用移液器枪头（或接种棒）轻挑放入试管中（试管要倾斜，切