细胞克隆形成实验.docVIP

1．2．3克隆形成分析 1 药物处理 T25培养瓶中细胞以基础培养基洗1遍，并在基础培养基中饥饿2d时，然后 换回条件培养基，以恩度 200ng／m1 、顺铂 8pM 以及两药联合使用，标准 条件下孵育细胞6d,时。其中，涉及到恩度处理时，在饥饿后半程即以相应浓度 的恩度预处理细胞1小时。实验设对照 contr01 。 2 细胞接种 吸弃培养基，胰酶工作液分别收集细胞，以条件培养基洗2遍后，将细胞悬 浮于条件培养基中，计数3次，取均值，调整细胞悬液浓度至1 x103／ml。6孔培养 板中加入2．6ml条件培养／孔，在C02培养箱中平衡后，每孔加入0．4ml细胞悬液 400个细胞 ，终体积为3ml。接种时十字方向摇晃培养板，振动培养板边，使 细胞尽量均匀分布。其中，涉及到恩度处理过的细胞，在接种过程中使用含有 200ng／ml,恩,度的条件培养基。 3 细胞培养 细胞在标准条件下培养2～3周，每3天更换条件培养基，观察克隆形成情况。 其中，以恩度干预的细胞，换液时使用含有该浓度恩度的条件培养基。 4 克隆染色 当细胞形成肉眼可见的克隆 每个克隆细胞数在50--150个左右 时终止培 养。弃去培养基，用DPBS O．01moUL，pH 7．4 小心浸洗细胞2次后，加入甲醇 lml／孔，固定15min后，弃去固定液，以流水缓慢冲洗干净，每孔加入lml的姬姆 萨使用液染色30min，以流水缓慢洗去染色液，通风橱中干燥。 5 克隆计数 将培养板放置在凝胶成像系统，使用可见光条件，以随机所带软件计数克 隆数目，扫描并保存图像。克隆形成率 ％ 克隆数目／接种细胞数x100％。调 整后的克隆形成率 ％ 克隆形成率 ％ ／对照组克隆形成率 ％ 。每种药物 处理的细胞样本接种3个复孔，独立重复3次实验。