细胞培养室细胞培养技术.docVIP

皖南医学院病生细胞培养室细胞培养技术 细胞培养分为原代和传代两种培养方式，由于本室重点在于肿瘤细胞的传代培养，现将个人传代细胞培养的操作方法总结如下：如有不全或者不妥之处，请指正。 传代定义：将现有的经过鉴定的细胞株，从原培养瓶中加以分离，稀释后接种于新的培养瓶中的过程，即为传代。 1.无菌操作基本技术 （1.实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，并在照射后开启抽风扇20 分钟后，才能开始实验操作。每次操作尽量只处理一种细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75 %酒精擦拭无菌操作台面，再开紫外线30分钟。 （2. 进出应该及时换鞋，在操作时应该穿戴无菌操作衣，口罩，一次性手套，一切物品进入无菌操作台，必须用酒精擦拭。 （3. 小心取用无菌的实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打 开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 （4、在无菌台操作时，尽量让培养瓶贴近酒精灯。 2. 定期检测下列项目： （1. CO2 钢瓶之CO2 压力 （2. CO2 培养箱的CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染是否加硫酸铜 水盘的水用无菌水，每周更换 。 3.实验用品 （1. 种类︰ 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器必须高压消毒，其它均为一次性塑料无菌制品。 器材 20ml培养瓶 5ml吸管 离心管 酒精棉球 酒精灯 移液器 酒精 封口膜 冻存管 试剂 培养基（1640 高糖） 缓冲液 消化液 冻存液 胰酶 牛血清 双抗 设备 无菌操作台 离心机 倒置显微镜 CO2培养箱 -80冰箱 高压锅 4，实验步骤 根据细胞生长的特点，传代方法有3种： （1、悬浮生长细胞传代 （1）将原代培养的细胞连同培养液一起转入离心管 （2）离心（800--1000转/分）离心5分钟后去上清 （3）沉淀物加新培养液后，吹打，再混匀按1：2传代。 （2、半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。视具体考虑是否使用消化液 （3、贴壁生长细胞传代 （1）吸光培养瓶中的培养液，用少量缓冲液冲洗培养瓶一次 （2）加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液 以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min。细胞贴壁特别牢固的可以放入培养箱加温，肉眼消化瓶底呈现流沙状或者显微镜下动态监测。 （3）吸去胰蛋白酶液，加入新培养液。（有时担心量少也可不去除胰酶，直接加培养液） （4）用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，（最好不要太多气泡）形成细胞悬液。 （5）视具体情况，需要分瓶者加入10ml,吸取5ml细胞悬液，接种于新的培养瓶内。如果不想分瓶而细胞太满可丢弃一半。 （6）在显微镜下观察妥当后，放入培养箱中培养。 5，培养液的配置 一般培养液没有一个固定比例，大致参考如下，89%培养基+ 10%胎牛血清+ 1%双抗 视细胞的生长需求胎牛血清可适当增加和减少（由于培养基不能久置，前期少量） 6.冷冻细胞复苏 冷冻细胞之复苏原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 细胞活化后，约需一到数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常材料 （1.实验用品 37°C 恒温水槽（在复苏前就要开启） 新鲜培养液 无菌吸管 离心管 培养瓶 （2. 步骤： （1） 操作人员应戴手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害和冻伤。 （2）自—80冰箱取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 3 迅速置于37 °C 水槽中回温，轻轻震荡，一分钟内取出，以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。 4 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内 稀释比例为1:10～1:15 ，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。 7.细胞的冻存 1、取对数生长期细胞，（细胞状态好）经胰酶消化后， 2、收集消化细胞于离心管中，800—1000r/min离心5min 3．弃上清液，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml ； 4、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称冻存人和冷冻日期。 5．依次放入4°C15min –20°C30min 最后 —80°保存 8.细胞培养污染的检测 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 （1.细菌和真菌的污染和检测 （1