细胞工程实验诱导细胞融合.docVIP

诱导细胞融合——聚乙二醇法 实验目的： 了解细胞融合的原理，初步掌握用PEG诱导细胞融合的方法。 生物的、物理的、化学的 ，使两个或两个以上 的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。 20世纪50年代，并迅速 成为一门新兴技术。由于不仅同种细胞可以融 合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也 于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域， 并且取得显著的成绩。 PEG 结构为：HOH2C CH20CH2 nCH2OH，相对分子质量在200-6000均可 从而使细胞发生融合：细胞融合率是指在显微镜 野内所有细胞 包括已融合的细胞 的细胞核总 数之比，通常以百分比表示。该方法的优点是： 实验材料用品： 材料：蟾蜍血红细胞，鸡血红细胞。 试剂： 1 Alsver液：葡萄糖2.05 g，柠檬酸钠 0.8 g，氯化钠0.42 g，用柠檬酸溶液调节pH值至7.2,最后用重蒸水定容至100 mL 即可。 2 0.85％生理盐水：0.85g氯化钠溶于 100mL重蒸水中。 3 GKN液：氯化钠8 g，氯化钾0.4 g， 1.77g，磷酸二氢钠0.69g，葡萄糖2 g，酚红0.01 g，溶于1000mL重蒸水中。 4 Ringer溶液：氯化钙0.25g，氯化钾 0.42g，氯化钠6.5g 恒温动物8.5g 溶于1000mL蒸馏水中。 5 氯化钙0.14g ,氯化钾 0.4g , 磷酸二氢钾0.06g ,氯化镁0.10g , 氯化钠8.0g ,碳酸氢钠0.35g , 七水磷酸氢二钠0.09g ,D-葡萄糖1.0g,酚红0.01g 6 50％PEG混合液：称取少许PEG Mw 4000 放人刻度离心管内，在沸水浴中加热， 50℃时，加入预热至50℃ 的等体积的GKN液，混匀。注意使用前配制。 仪器：显微镜，离心机，水浴箱，电炉， 量筒，离心管，注射器，试管，移液管，烧杯， 吸管，载玻片，盖玻片，显微镜。 1.细胞悬液的制备： 1 蟾蜍血红细胞悬液的制备：用注射器吸入1mL　Alsver液后，从蟾蜍主动脉弓取血1mL 2mLAlsver液 封口 后可4℃冰箱内可保存1周 ；放入刻度离心 管内，按照3：1 V／V 加入6mL Alsver液混匀，放入4℃冰箱内可保存3--4天。 2 鸡血红细胞悬液的制备：用注射器吸入 1mL　Alsver液后从鸡翼下静脉取鸡血2mL，注 3：1 V／V 加入6mL Alsver液混匀，放入4℃冰箱内可保存3--4天。（主动脉弓取血前处理方法） 2.取细胞悬液1mL，移人10mL离心管， 加入4mL0.85％生理盐水混匀。1500r／min离心5 min。 3.弃上清液 用吸管吸去 ，加0.85％生理 盐水至5mL，混匀后1500r／min离心5min。 4.重复上述条件，再离心洗涤1次。 5.收集最后1次离心沉淀的血细胞，加入 适量的GKN液或Ringer溶液，按压积红细胞体积配成10％的红细胞悬液。 6.取悬液1mL到1个试管中，加入0.5～0.8 mL预热的50％PEG混匀，置于37℃水浴中温浴2min； Ringer或Hanks液5ml以终止PEG的作用;取血细胞悬液1滴滴于载玻片上，再加入0.2%次甲基蓝溶液1滴,盖上盖玻片。 7.利用光学显微镜或倒置显微镜 高倍 观察2个靠近细胞或3个细胞形成融合的过程。 8.进行多个视野的测定，统计平均融合率。 作业：　1、绘制观察到的细胞融合图。 2、计算观察到的细胞融合率。 场 法 高 压脉冲电场，场强为kV／cm量级，脉冲宽度为 卜q量级 的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿， 钟内恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细 胞的接轴区时，即可诱导它们的膜相互融合，导 优点。实验九 试剂：1% W／V 纤维素酶,1% W／V 果胶酶,0.7mol／L甘露醇;10mmol/L CaCl2.2H2O,0.7mmol/L KH2PO4,pH 6.8～7.0。 用具：离心机，振荡器，电融合仪，细 胞融合池。 1、将制备原生质体悬液以1000r／min离心5min，用超纯水配制的0.6 M甘露醇 清洗，重复两次。 2、吸去上清夜，再用0．6 M甘露醇将细胞密度调整成5*104ml混匀。 3、开启电融合仪电源，将正弦交变电场频率选择在1～1．30MHz左右，正弦交 15V左右，占空比为50％，直流脉冲电压为200V，电脉冲宽度为10～100 μs，脉冲个数为2个。 4、用移液枪将原生质体悬液吸入电融合室中，置于显微镜下接上电极，待观察。 5、给原生质体悬液施加正弦交变电场，由低到高分别调节交变电场频率和电压， 体相互成串后，发生有效接触后，立即庙低到液施以电脉冲。高在显微镜下 6、静止片刻在显微镜下观察原生质体在被施加电脉冲前