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基于微流控芯片的循环肿瘤细胞的分离、检测技术 　　摘要： 循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）是自肿瘤原发灶或转移灶脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，是肿瘤远处转移的标志。CTCs有助于癌症的早期诊断、判断疗效、个体化治疗方案制订及诊断预后。随着检测技术的不断改进，CTCs检测成为临床研究的热点，其中，微流控芯片以其高通量高效率以及低成本的特点迅速发展并被广泛研究应用。该课题对CTCs最新检测方法的研究以及未来的发展趋势进行综述，特别剖析结合微流体技术和纳米技术的微流控芯片是如何被应用于循环肿瘤细胞的分离、富集以及检测的，评估各种方法的优缺点，并探讨未来循环中流细胞检测技术的难点和方式。 　　关键词：循环肿瘤细胞；微流控芯片；细胞检测 　　中图分类号：TP18 文献标识码：A 文章编号：1009-3044（2014）09-2093-02 　　近年来，恶性肿瘤导致的死亡率在所有疾病的死亡率中位居前列，而肿瘤细胞具有的侵袭和转移能力正是恶性肿瘤的高致死率的诱因 [1]。循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs）是自肿瘤原发灶或转移灶脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，是肿瘤远处转移的一种标志。因此，基于循环肿瘤细胞的肿瘤转移的检测就显得至关重要。 　　微流控芯片以其低成本、易操作、便携式、低损伤、高准确性成为当前各类CTCs检测方式中最热门的一种方式。基于微流控芯片的相应方法的成功实现及运用，不仅将对肿瘤早期检测和预后的判断有重大意义，而且对临床治疗的指导也有很大价值。 　　1 CTCs概念 　　根据目前的研究，CTCs被定义为因诊疗操作或自发由实体肿瘤或转移灶释放而进入外周血循环的肿瘤细胞。进入循环而未被清除的肿瘤细胞通过微迁移、黏附以及相互聚集形成一定体积的微小癌栓，并在相应条件下发展为转移灶[2]。 　　CTCs在外周血中的数量极少，通常在每106～107个白细胞中才能寻找出仅有的数个肿瘤细胞，因而要进行CTCs检测通常必须先进行细胞富集，以提高检测灵敏度。细胞富集可通过肿瘤细胞的特异性标志物或者细胞形态特征如细胞密度和体积等来实现。其中免疫磁性分选法是目前最常用的CTCs富集方法。当前较为常用的CTCs分离检测手段则有CTCs微流控芯片技术、流式荧光检测仪、CellSearch检测、膜过滤法、密度梯度离心法。 　　2 微流控芯片的制备工艺和研究 　　目前，微流控芯片主要以PDMS为芯片材料，以玻璃为基底材料。其中PDMS具有非常理想的材料特性，尤其表现在作为构建微流控芯片的主要材料时。 　　近年来，由于PDMS易于加工成型，图形效果好，光学透性好且兼容荧光检测等，低毒性、加工容易，且容易和自身以及其他多种材料封接，对温度等环境的要求也不多等诸多优点，因此受到了各方广泛关注。首先，PDMS因为弹性好，在脱模过程中，加工出来的PDMS微通道在保持模具完整无损的情况下，能够轻松剥离出来，从而实现模具的重复利用[3]。另外，PDMS柔性好，易于吸附在其他材质的衬底之上，而且PDMS与相对粗糙的表面接触非常紧密，经过处理后，与基底封接效果好，键合工艺简单，浇铸法制备PDMS结构具有较高的成型质量。PDMS的电绝缘性也很好，因而被运用于各种主流毛细管电泳芯片的制作；PDMS对温度等也很不敏感且具有化学惰性，与大部分待检测液体都不会发生反应，因而具有很高的生物兼容性，满足大量不同生物实验的要求。迄今为止，以PDMS为主要加工制备材料的微流控芯片已被广泛应用到医学和生命科学等领域。 　　3 不同微流控芯片技术的原理及方式 　　3.1 基于循环肿瘤细胞大小的微流控芯片技术 　　利用肿瘤细胞与其它血细胞的大小以及刚度不同的物理性质可以对循环肿瘤细胞进行分离。根据肿瘤细胞与血细胞直径的不同，设计一定直径的滤孔，可以实现循环肿瘤细胞的分离。ISET联合激光扫描细胞计量仪（lasereanningeytometry，LSC）的原理即是利用肿瘤细胞通常比外周血液中其它细胞大的特性，采用孔径为8μm的滤膜，将肿瘤细胞从血液中分离出来，通过不同荧光标记细胞来进行进一步鉴定，应用LSC对已经过荧光抗体标记的细胞进行扫描并识别，进而可以准确计算出血液中含有的微量肿瘤细胞。常用的荧光抗体有抗CK抗体。经过研究表明，此方法已成功被运用于从乳腺癌、前列腺癌以及肺癌患者的血液中检测出CTCs。此方法较之CellSearch系统而言，其细胞富集过程相对容易，它不依赖抗原抗体反应而是直接过滤外周血进行肿瘤细胞富集，不但不破坏肿瘤细胞的形态学特征而且减小了肿瘤细胞的丢失，同时它能将丢失了上皮细胞特征的肿瘤细胞分离出来，并且应用激光扫描细胞计量仪对所检测到的阳性细胞进行进一步目测