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双菌混合发酵产蛋白酶条件的研究 　　摘 要：本试验通过探究黑曲霉单菌发酵培养与黑曲霉和木霉混合发酵培养产蛋白酶的活性比较，从发酵反应温度和装液量2方面比较混菌培养对产酶活性的影响。试验发现，在40℃下混菌发酵所产酶活力比单菌发酵所产酶活力高4.8U/mL，装液量为50mL时混菌的酶活高出单菌的酶活5.1U/mL。试验表明木霉与黑曲霉混合培养产酶是可行的，并优于单一菌种培养。 　　关键词：黑曲霉；木霉；蛋白酶；混菌发酵 　　中图分类号：Q814.4 文献标识码：A 　　蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，因其分子较小，功能较简单等特点[1]，目前对于蛋白酶的研究大多集中在酶的生产技术和产量的提高方面[2]。关于蛋白酶的生产方法，以往研究较多是单菌株发酵产蛋白酶，混合菌株发酵研究较少。近年来，国内外学者开始关注混菌发酵并通过采用多菌混合培养的方式生产目标酶制剂，以此种方式提高酶的产量及产酶的活力[3]。 　　本试验向发酵培养基中添加20g/L苹果渣充当碳源，通过对发酵温度和装液量的优化，对比单菌与双菌发酵产蛋白酶活力，探索双菌发酵产蛋白酶的优势，以期提高蛋白酶的产量，作为饲料添加剂应用于畜牧业中[4-6]，提高饲料利用率。 　　1材料与方法 　　1.1菌种及试剂 　　苹果购于市场；黑曲霉、木霉由本校实验室提供；其他试剂均为分析纯。 　　1.2培养基配制 　　蛋白酶筛选培养基，种子培养基，双菌混合液体发酵培养基[7，8]。 　　1.3木霉、黑曲霉的接种 　　将木霉、黑曲霉接种到斜面培养基上30℃培养48h，置于4℃中待用。 　　1.4高产蛋白酶菌株的筛选 　　取制备好的黑曲霉菌悬液1mL加入到蛋白酶筛选培养基上，涂布均匀，28℃恒温培养2～4天，观察透明圈长势。 　　1.5温度对产蛋白酶的影响 　　黑曲霉的最适产酶温度在30℃～50℃之间，所以取活化好的黑曲霉和木霉种子液分别接种到单菌和双菌发酵培养基中，于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃摇床培养。 　　1.6装液量对产蛋白酶的影响 　　在250mL摇瓶中分别装入30mL、40mL、50mL、60mL、70mL的单菌和双菌液体发酵培养基。取活化好的黑曲霉和木霉种子液等比例接种到培养基中，40℃摇床培养。 　　1.7蛋白酶活力测定 　　取适当稀释的粗酶液1mL，在37℃水浴中预热2min，再加入同样预热的2%酪蛋白1mL，保温10min后沸水浴7min终止反应，继续在37℃水浴中保温10min，使沉淀完全，过滤，取滤液 1mL，加入福林A液5mL与福林B液1mL，37℃下反应20min，在680nm下测定光密度值。以先进行灭活后加酪蛋白沉淀过滤的酶液，作为空白对照。 　　蛋白酶酶活定义为：37℃条件下，每分钟水解酪蛋白产生1?g酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位U。 　　2 结果与讨论 　　2.1发酵菌株筛选结果 　　将活化的黑曲霉菌株接种于蛋白酶筛选培养基，发现平板上菌落呈黑色，选取生长状态好，菌落周围的透明水解圈较大且透明度高的菌株为发酵菌。 　　2.2温度对产蛋白酶影响结果分析 见表1。 　　从表1得知在温度为40℃时，单菌和双菌发酵产蛋白酶活力最好，分别为409.7U/mL和413.5U/mL。双菌比单菌产蛋白酶的活力提高了3.8U/mL。 　　表1 温度对单双菌产蛋白酶活力影响的结果 　　组别 温度/℃ 单菌发酵蛋白酶活力/U/mL 双菌发酵蛋白酶活力/U/mL 　　1 30 182.9 185.6 　　2 35 301.5 304.8 　　3 40 409.7 413.5 　　4 45 326.3 328.5 　　5 50 298.5 301.0 　　2.3 装液量对产蛋白酶影响结果分析 见表2。 　　从表2得知在250mL的摇瓶中装50mL的培养基单双菌产蛋白酶的活力最好，分别为445.5U/mL和450.6U/mL。双菌比单菌产蛋白酶活力提高了5.1U/mL。 　　表2 不同装液量对混菌产酶的影响 　　组别 装液量/mL 单菌发酵蛋白酶活力/U/mL 双菌发酵蛋白酶活力/U/mL 　　1 30 334.5 380.2 　　2 40 396.2 401.6 　　3 50 445.5 450.6 　　4 60 370.8 414.3 　　5 70 320.5 376.4 　　经试验发现，通过对发酵温度和装液量这两种发酵产蛋白酶条件的优化，使双菌产蛋白酶的活力明显比单菌产蛋白酶活力有所提高，可见双菌混合发酵比单菌发酵有一定的优越性。木霉产纤维素酶可辅助苹果渣中蛋白类物质的释放，进而诱导黑曲霉蛋白酶的产生，用混菌发酵是利用各菌之间的协同作用，提高发酵效益，促进动物对饲料中营养物质的吸收。