猪流性腹泻腹泻病毒的假病毒相关研究重点.docVIP

猪流行性腹泻病毒 摘 要 猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒属，冠状病毒科，能够导致仔猪严重腹泻，给养猪业带来重大的经济损失。S蛋白作为PEDV最主要的膜蛋白，已有报道证实S蛋白含有病毒感染细胞的抗原表位区，但关于S蛋白介导PEDV进入细胞还有待于进一步研究，故本主要通过构建PEDV S1的伪型病毒研究富含抗原表位区的S1蛋白在PEDV进入细胞中的作用。 本研究中，首先，为有效的检测PEDV，利用Vero E6繁殖的PEDV做为抗原，制备PEDV全病毒多克隆抗体。利用ELISA和间接免疫荧光对抗体的效价和特异性进行检测，结果显示该多克隆抗体与PEDV有很好的特异性反应。 其次，为研究PEDV的感染特性，摒弃非同源细胞系，对PEDV在猪小肠上皮细胞（IEC）上进行适应培养，通过在IEC细胞中盲传10代，对第10代病毒液进行检测。反转录PCR、间接免疫荧光和电镜检查均证实PEDV能够感染IEC细胞系，并稳定传代，故最终确定IEC是PEDV的易感细胞系。 再次，为研究PEDV S1蛋白功能，构建S1蛋白的真核表达质粒，建立稳定表达S1蛋白的BHK-21细胞系，命名为BHK-S1。反转录PCR和间接免疫荧光鉴定，成功构建了BHK-S1稳定细胞系。利用BHK-S1稳定细胞系和重组的VSV系统，成功制备PEDV的伪型病毒VSVΔG*S1。反转录PCR和激光共聚焦检测结果显示，重组病毒构建成功。 最后，为研究S1蛋白在VSVΔG*S1感染IEC细胞中的作用，对感染VSVΔG*S1的IEC细胞中的S1蛋白进行动态定位。激光共聚焦结果显示，S1蛋白在病毒感染IEC细胞系的吸附和进入过程中发挥关键作用。本研究为进一步检测PEDV提供了有效实用的实验材料，为研究PEDV的感染特性和探索S1蛋白在PEDV感染细胞时的作用提供了参考。 关键词：猪流行性腹泻病毒；易感细胞系；稳定表达系；假病毒；感染特性 1 猪流行性腹泻病毒 1.1 PEDV的根源 猪流行性腹泻病毒（PEDV）从属于冠状病毒科，冠状病毒属，是单链，有包膜的RNA病毒，与其他冠状病毒类似，其病毒粒子形态呈多形性，大多数类似球形，大小平均为130 nm，外有囊膜，纤突呈花瓣状，纤突大小介于18-23 nm，呈放射分布，病毒粒子的中央称为电子不透明区。然而，人们对于病毒内部的了解甚少。在欧洲，青年种猪，育肥猪和架子猪主要被猪流行性腹泻病毒感染。而在我国，猪流行性腹泻病毒感染多个年龄的猪群[1]。冬季，由于猪流行性腹泻病毒引起的病毒性腹泻，母猪以及哺乳仔猪感染该病毒几率较低于育肥猪和保育猪群[2]。该腹泻病毒引起的腹泻病的临床症状大都表现为感染猪食欲废绝或者减退，精神不振，眼窝下陷，明显的全身脱水，水样腹泻，伴有呕吐，其粪便稀少，颜色呈灰黄色或者黄色，腹泻时间3-4天后，病猪将会由于脱水过重而死亡。猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎(TGE) 的临床症状较为相似。二者相比，前者传播较慢，但持续时间较长，腹泻的程度与后者相比也较轻[3]。 于1971年，猪流行性腹泻首次在英国发现[4]。由Debouck等成功分离得到猪流行性腹泻病毒则在1978年，将之定名CV777。随后关于该病毒在多个国家被相继报道[6]，尤其在美国、韩国和朝鲜等。因为该病毒将近传遍欧洲，有学者将该病叫做“流行性病毒性腹泻(EVD)”，于1976年，首次报道了与猪传染性胃肠炎相似的，可以危害哺乳仔猪的急性腹泻。人们为了排除已知的肠道致病性病原以及猪传染性胃肠炎病毒，故将该病亦称为“EVDII型”，为了和早期发现的”EVD型I”分开。直至20世纪的80年代初，各国学者证实此两种引起病毒性腹泻的病原都是同一种冠状病毒，此后，一致命名为“猪流行性腹泻(PED)”[5]。 1.2 PED流行病学 自1978年在比利时首次分离得到PEDV后，从20世纪的80年代到90年代，该病在欧洲大面积爆发，包括荷兰、英国以及瑞士等。然而，在亚洲的爆发更为严重，中国、泰国、韩国以及日本尤为明显。随后，于2012年，该病在美国多个州盛行，包括科罗拉多州、爱荷华州和明尼苏达州等。大部分的爆发集中在10日龄的仔猪，日前，PED仍在世界范围内呈大面积流行，给各地养猪业带来不同程度的损失。 1.3 PEDV基因结构 PEDV结构为有包膜，单股正链的线性RNA病毒，与其他冠状病毒成员相似。基因组全长26950~32950 nt，5’端含有一个帽子结构（cap），3’端含有一个Poly（A）尾巴，且其3’端和3’端分别包含一个非翻译区（5’UTR和3’UTR）。目前已发现的7个开放阅读框从5’端到3’端的顺序依次为：ORFla（11000~13000 nt）、ORFlb（8000~9000 nt）、S基因（4100~4250 nt）、ORF