医学免疫学与微生物学网上教学活动 ...pptVIP

1、基本原理 PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段。 （1）引物设计与合成 设计合成一对与目的DNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。其中一引物与目的区段上游一条模板链的序列相互补，而另一引物与目的区段下游另一条模板链的序列相互补。 （4）引物延伸 将反应体系温度升到72℃左右，在Mg2+存在的条件下，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端（5’→3’方向延伸），使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。 以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸），新合成的链可作为下一轮循环的模板 PCR原理Flash 演示 （2）反应条件 3、引物的复性（退火）温度 复性温度的选择可以根据引物的长度及其G+C的含量确定。 当长度在15~25bp时，引物的复性（退火）温度可以通过Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到。 在Tm允许范围内，Tm越高，PCR特异性越强。 4、PCR引物设计的一般原则 （1）序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度适宜，一般为1