多聚酶链式反应答案.docVIP

山东省平度市第一中学 生 物 学 课 时 授 课 导 学 案 序??? 号： 15 主备：刘贵溪 审查：付亚楠 审批 〖课 ???题〗ξ5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 〖学习要求〗尝试PCR技术的基本操作，体验PCR技术的分子生物学实验方法；理解PCR技术的原理；讨论PCR技术的应用 【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。 一、基础知识 【活动1】阅读教材P58“PCR原理”，讨论并回答下列问题： 1．（记忆）PCR技术扩增DNA的过程与细胞内的DNA复制过程类似。 【思考1】填写下表：（记忆）细胞内DNA复制条件分析 条件 参与的组分 在DNA分子复制中的作用 模板 DNA的两条单链 提供复制的模板 原料 四种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 酶 解旋酶 打开DNA双螺旋 RNA聚合酶 合成RNA引物 DNA聚合酶 催化合成DNA子链；切除引物 DNA连接酶 将不连续的DNA子链连接起来 能量 ATP 为解螺旋和合成子链提供能量 引物 RNA 为DNA聚合酶提供合成的3’端起点 2．（理解）细胞内DNA的复制 （1）DNA的结构：脱氧核苷酸分子通过3,5－磷酸二酯键连接形成核苷酸长链，两条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化，形成DNA双螺旋结构。 （2）DNA的复制：首先，在解旋酶的作用下，由ATP供能，DNA发生解旋形成两条DNA单链。其次，在DNA单链的3’端，在RNA聚合酶在作用下，合成RNA引物。再次，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3’端开始合成DNA子链。最后，DNA聚合酶将引物切去，并合成空缺处DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来。 3．（记忆）DNA分子复制的人工控制 解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。 恢复螺旋：在50～60℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。 复制条件：缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。 控制仪器：PCR仪（温度周期性自动调节仪）。 【思考2】缓冲液相当细胞内的什么成分？核液。 【活动2】阅读教材P59“PCR的反应过程”，讨论并回答下列问题： 1．（记忆）填写PCR反应流程： 2．（理解）PCR反应过程是：在升温至90℃以上时DNA解旋；在降温至50℃左右时引物与DNA单链结合；在升温至72℃左右时合成DNA子链。 二、实验操作 【活动3】阅读教材P62“实验操作”，讨论并回答下列问题： 1．（记忆）在PCR反应体系的配方中，含有的成分有缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物、水。 2．（了解）实验操作步骤：按照PCR反应体系配方配制反应液；将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；将微量离心管放到PCR仪中；设置PCR仪的工作参数；DNA在PCR仪中大量扩增。 3．（了解）水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃恒温水浴锅中循环处理。 三、操作提示 【活动4】阅读教材P62“操作提示”，讨论并回答下列问题： 1．（记忆）避免外源DNA污染，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。 2．（记忆）将缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。 3．（记忆）每添加一种反应成分，更换一个移液器枪头。 4．（记忆）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。 四、结果分析与评价 【活动4】阅读教材P63“结果分析与评价”，讨论并回答下列问题： 1．（记忆）反应液稀释：取2μLPCR反应液，添加98μL蒸馏水。 2．（记忆）分光光度计调零：将100μL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计读数调节为零。 3．（记忆）将100μL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。 4．（记忆）DNA含量计算：DNA含量（μg）＝50×光吸收值×稀释倍数。 【活动4】观看视频：观看“多聚酶链式反应扩增DNA片段”视频，学会相关技术方法。 〖课后学习〗 1．实践作业：利用网络搜集有关PCR技术的资料或视频。 2．书面作业：将基础知识整理到作业本上；完成该节训练题。