科研思路和方法作业要点.doc

从MHCⅠ/Ⅱ类探讨针灸对带状疱疹的免疫逃避作用 研究内容、研究目标、以及拟解决的关键问题 1课题以MHCⅠ/Ⅱ类基因围绕IFN-和的途径，有目的地观察IFN-和相关MHCⅠ、MHCⅡ的表达量、分布及变化规律，进一步检测的表达变化以及的动态变化，并对上述指标的相关性及变化规律进行分析，说明是灸、的关键。 且明确针刺与作用机制的差异。 主要开展以下工作： IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。 （5）western blot检测：IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ蛋白量的表达。 （6）RT-PCR法2.研究目标： 旨在明确灸，，与MHCⅠ/Ⅱ类表达关系 2.2.2通过针灸理论。 2.2.3旨在明确与作用差异。 3拟解决的关键性问题： MHCⅠ/Ⅱ类拟采用的方案及可行性分析 1拟采用的方案 实验环境：实验室相对封闭，自然采光，环境温度控制在20～25之间，湿度控制在60%左右。实验动物：级，体重22～24g笼养，自由饮食，由实验动物中心提供全价动物颗粒饲料。 .1分组及造模： 腹腔注射，，。 模型组：造模方法同上每天陪同正常组、针刺组、组固定，连续天。药物组：造模方法同上。左侧腹腔注射ACV0.1g/kg/d，连续三天，每天陪同正常组、针刺组、组固定，连续天。针刺组：造模方法同上。按照造模时间的先后顺序，在造模完成后，开始针刺，进针0.2～0.3mm，留针10min，每1次，连续天。 组：造模方法同上。按照造模时间的先后顺序，连续天。 组：连续天。正常组：腹腔注射生理盐水。每天陪同模型组、针刺组、艾灸组固定，连续天。 1.2 取材方法： 造模后随机处死8只取材鼠针刺组、组后随机处死8只鼠取材。取材放入-80oC低温冰箱保存、备检。 1.3穴位选取： 固定鼠方法：根据鼠的形体，在木板上钉上四个适当距离的铁钉，将夹子套在铁钉上，用夹子夹住鼠的四肢以做固定。鼠穴位定位参考《实验针灸学》，模拟鼠的定位方法：“大椎”在第七颈椎与第一胸椎间；“膈俞”在第七胸椎下两旁肋间，左右侧各一穴；“尺泽”在1.4 观察指标及方法：各组鼠每天定时，专人割尾静脉采血0μl，加入0.38ml的白细胞稀释液中，摇匀，静置3分钟，查外周血白细胞数和细胞分类计数制备样品：处死动物，用流细胞仪上机检测并进行分选。流细胞仪检测：将分选细胞清洗、离心(1500RPM10min)，清洗两次，弃上清；加入PI荧光标记抗体；用流细胞仪分别检测分析方法：测出的数据经PHOENIX公司分析软件Multicycle处理得出细胞各周期的相对含量和百分数,并绘出DNA分布的直方图。 IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。 ① 制备样品：处死动物，取股骨骨髓，10%福尔马林固定标本，石蜡包埋，4μm厚切片。 免疫组化染色检测方法：鼠抗人IFN-单克隆抗体(DO-27)（，浓度1:50）；鼠抗人 cyclinD1单克隆抗体（DCS/6）（NeoMarker福州迈新公司，浓度1:100）；鼠抗人单克隆抗体MHCⅠ、MHCⅡ（晶美公司）；S-P免疫组化试剂盒（北京中山公司）。： ③ 分析方法：IFN-MHCⅠ、MHCⅡ免疫组化阳性信号均为棕黄色细颗粒状，染色结果按阳性细胞百分比及染色强度综合记分作半定量分析。 western blot检测：IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ蛋白量的表达。 ①制备样品：取样品1×106～1×107细胞，PBS清洗，去PBS加0.1～1ml总蛋白抽提试剂抽提总蛋白使用KCTMBCA蛋白质定量试剂盒，测定样品浓度。 方法：变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS)蛋白质转移到硝酸纤维膜，30mA恒流，4°C转移，过夜膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时，加入一级抗体室温孵育1.5小时；加入HRP标记的二级抗体，室温孵育1小时化学发光法检测，X胶片曝光显影。 分析方法：扫描图片，用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化；将目的蛋白灰度值除以内参GAPDF的灰度值，校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 法 提取总RNA：取标本，用试剂(GIB-CO公司，美国)提取总RNA，溶于无RNA酶的灭菌超纯水中，用紫外分光分度计测定总RNA的浓度和纯度，同时琼脂糖电泳观察其完整性。将RNA稀释成1mg/L，-80°C保存。 ② MHCⅠ、MHCⅡ和β-actin引物序列 MHCⅠ: 5’- TGTCCCGGCCCGGCCTCGGG-3’ 5’-TCTCAGCAGGGTAGAAGCTA- 3’ MHCⅡ: 5’-ACCAACGGGACGAGC