间接ELISA测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究.docVIP

间接ELISA法测定肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究 免疫学杂志 1999年第4期第15卷 技术与方法 作者：邓瑞春 白云秀 张明伟 汪劲松 黄 英 毛 宁 单位：军事医学科学院瑞得四环生物技术研究所 北京 100850 关键词：酶联免疫吸附测定 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 大肠杆菌 　　摘 要 采用大肠杆菌DH5α菌体蛋白免疫家兔制备抗血清，建立了间接ELISA方法经初步测定，该方法的灵敏度0．5ng／ml，比聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮蓝染色方法的灵敏度高3 000倍，比银染色方法的灵敏度高150倍。在20～620ng／ml范围内测定呈直线关系，直线相关系为0.895。经8次重复测定，显示很好的重复性。可用于测定rhGM-CSF等基因工程产品中DH5α菌体蛋白的残余量。 　　中图号 R371-34 　　DETERMINATION OF THE E．COLI DH5α PROTEIN REMAINS IN 　　GENIC ENGINEERING SEMI-FINISHED PRODUCT GM-CSF Deng Ruichun， Bai Yunxiu， Zhang Mingwei， Wang Jinsong， Huang Ying， Mao Ning 　　（Read Four-Ring Institute of Biotechnology， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850） 　　Abstract The antiserum were prepared against the total DH5α protein by immunizing rabbits， and then a method was established to determine the remnants E．coli DH5α protein in the gene engineering semi-finished pro-duct of rhGM-CSF． The sensitivity is about 0．5ng／ml， 3 000 times higher than that of Coomasie Briliant Blue stai-ning and 150 times than that of silver staining of PAGE． The linear range of the method is between 20-620ng／ml and the correlation coefficient（r） is 0．985， and repeativity is good． 　　Key words Enzyme-liked immunosorbentassay（ELISA），Recombine human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（rhGM-CSF）， Escherichia coli（E．coli） 　　大肠杆菌DH5α是目原核细胞表达系统中，应用最普遍的基因工程菌之。人重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、人重组白细胞介素-2（rhIL-2）、人重组干扰素-α（rhIFN-α）等外源基因，都是在该宿主菌中获得高效转录和表达的。随着对基因工程产品在临床上的大量应用，对产品中宿主蛋白残余量的要求越来越严格。目前常用来鉴定残余蛋白的方法有：聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），毛细管电泳（CE），等电聚焦（IEF），HPLC（包括凝胶过滤，各种反相HPLC，离子色谱，疏水色谱等）。此外，还有一些化学法如观察末端是否均一等等。本文建立了间接ELISA方法，它简便、快速、灵敏、经济，是一种非常值得推广的方法。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　大肠杆菌DH5α菌体蛋白，由本室培养制备；HRP-羊抗兔IgG，购自本院微生物流行病学研究所；Western印迹试剂盒，购自Sigma公司；卡介苗，购自北京生物制品所。BDSL Immunoskan 340型酶联仪，英国；电泳仪，购自北京六一仪器厂。 　　1.2 方法 　　1.2.1 大肠杆菌DH5α培养及菌体蛋白的测定［3，4］：于LB培养基中培养大肠杆菌DH5α，经离心收集菌体，生理盐水洗2次，超声破碎，离心15 000r／min 10min，收集上清菌体蛋白，紫外分光光度法测定蛋白光吸收值，通过公式：mg／ml蛋白＝1．45×OD280－0．74×OD260计算含量，SDS对DH5α菌体蛋白成分进行分析。 　　1．2.2 大肠杆菌DH5α菌体蛋白免疫：于免疫前1周，兔两侧腹股沟淋巴结注射卡介苗0．7mg，取4mg大肠杆菌DH5