PCR类型测序模注意事项.docVIP

PCR类型测序模板注意事项 总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。3ul样品总量不低于50ng(非常小的PCR产物可以酌情减小)，PCR产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。 对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将目的片段切下来并回收，建议将PCR产物作克隆后进行测序。有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。 经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物二聚体等影响测序反应的组分。有多种纯化方法可供选择，Promega，Qiagen和生工等公司都有相应的产品可供选择。纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(非常小的PCR产物可以酌情减小)。 与质粒模板相比，PCR产物彼此间差异很大，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR退火温度和PCR产物的长度，以供测序时参考。 PCR模板一般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进行测序。 纯化好的PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应。 若让公司对PCR产物进行纯化，PCR产物需满足∶总量不低于1ug/kb，片段长度不低于200bp 各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。 引物浓度的换算关系∶ 总ng数 = pmole x 分子量/1000 ? 由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到一个好的结果，请尽量满足上述要求。 ? 常见问题 具体情况 可能的原因 处理办法 备注 样品准备问题 菌培养不好或失败 抗性不对或菌已死 核对抗性，尽可能提供载体信息。 ? 或菌培养条件特殊 重新提供菌液，或提供2ug纯化质粒。 质粒提不出 质粒拷贝数极低或 客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。 ? 培养方式不当 质粒产量很低 低拷贝数质粒或 客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。 ? 培养方式不当 自带质粒或已纯化PCR产物量极低 是否为电泳法定量， 质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。 测OD值法不可靠,电泳检测 总量是否足够 已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。 测序出现双峰或信号中断 双峰 重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复 用反向引物测互补链。 此类问题主要与样品有关 质粒测序在插入序列中出现套峰 可能是样品非单克隆，挑其他克隆测序。 PCR产物测序中，某一点后序列变乱 可能是存在移码突变，这是正常的，也可以克隆后测序。 PCR产物中一个或多个位置有套峰 序列中存在突变，这是正常的，也可以克隆后进行测序。 PCR产物测序前部分双峰 引物二聚体污染或产物不纯，克隆后测序。 质粒测序时整个结果双峰 引物特异性不好，序列中存在通用引物的同源序列；改用其他引物测序。 质粒和PCR产物测序出现双峰 引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化，或纯化不好。重新合成引物测序。 信号迅速衰减或中断 模板GC二级结构区后 难以得到好的测序结果，亚克隆成较小的片段进行测序 ? 模板GT二级结构区后 测反向互补序列，AC结构不影响测序 ? 严重的重复结构 测反向互补序列 ? 模板特性决定的 根据具体情况决定 ? 信号极弱或无信号 模板质量差 重新提供菌液或纯化PCR产物 ? 质粒样品：引物不符 尽量提供载体详细信息，核查引物 ? 引物不适宜测序 测序引物比PCR引物要求高，随机引物和简并引物不能用于测序，较长的PCR引物也不能用于测序。重新设计引物测序，对PCR产物而言建议克隆到载体上用通用引物进行测序 ? 质粒产量极低 客户自己提供2ug纯化好的质粒 ? PCR产物定量极低 重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化 ? 测序结果正常，与预期不符 找不到引物 质粒模板 检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。 ? PCR模板 不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。 结果完全不对 请提