- 1、本文档共30页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
7 外源基因的克隆与表达
1972 Paul Berg Herb Boyer Produced the first recombinant DNA molecules. They Shared the 1980 Nobel Prize in Chemistry for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA, (一)pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA载体,有2个抗药性基因(四环素和氨苄青霉素),一个复制起始点和多个用于克隆的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时,它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆之用。 (二)pUC系列质粒是2.7Kb的双链DNA质粒,有一个复制起点,一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点,多克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段,用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株(M15)时,因为由质粒表达的α-肽补充了大肠杆菌却失的α-肽,所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上,长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA,由于它破坏了α-肽的表达,因而在加入IPTG和X-gal的培养基,不能长出蓝色克隆,这就是所谓的蓝白筛选。幻灯片 30 3 工程菌表达及条件的优化 诱导时间 30’ 1h 2h 3h 4h 5h 6h 诱导条件的优化 化学诱导 IPTG 温控诱导 42 pH、补料、化学物质(SDS)等。 * * 生物技术综合实验 Comprehensive experiments of biotechnology 主要内容 Contents: 一、课程简介 核酸的分离与纯化 Isolation and Purification of Nucleic Acid 二、电泳技术 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS三、聚合酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction 四、DNA序列测定 DNA Sequencing 五、分子杂交技术 Molecular Hybridization - Southern,Northern and Western Blot 六、基因文库和cDNA文库的构建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因的克隆与表达 Heterogenic Gene Cloning and Expression 八、蛋白质的分离、纯化技术 Isolation and Purification of Protein 7 外源基因的克隆与表达 Heterogenous Gene Cloning and Expression 基因工程诞生的历史背景: 1.核酸是生物遗传物质的实验证据(Avrey,1944) 2.DNA结构双螺旋模型 Watson Crick, 1953 3.DNA遗传密码的破译(1961~1966,Nineberg Crick ) 4.发现反转录酶 Baltimore Temin, 1970 5.染色体外遗传单位——质粒的深入研究 Lederberg, 1950-1970 6.发现DNA限制性内切酶(1968-1970,Arber,Smith和Nathans) 7. DNA体外重组( Cohen等,1973) Paul Berg Herb Boyer 1973年是基因工程的元年。 这座里程碑的树起,凝聚着几代科学家的心血与努力,他们在理论与技术上的卓越贡献,为基因工程的诞生奠定了坚实的基础。 一、基因克隆的策略与技术路线 克隆原指一个亲本细胞产生成千上万个相同细胞组成的群体的过程。 在分子水平,为了达到大量获取同一基因或基因的表达产物这一目的,采取体外进行靶DNA分子与某一微生物载体杂合,导入宿主细胞,通过自主复制而产生大量相同的基因或基因产物。这是目前基因克隆的主要策略。 1.基因克隆的策略 克隆外源DNA基本流程图示 2. DNA克隆技术涉及的主要过程与方法 (1)分离制备待克隆的DNA片段; (2)将靶DNA片段与载体在体外进行连接; (3)重组DNA分子转入宿主细胞; (4)筛选、鉴定和扩增阳性重组子; 2.1 分离制备待克隆的DNA片段的方法 (1)用DNA限制性内切酶切割细胞DNA,然后
您可能关注的文档
- 抓住5点妇科肿瘤早知道x.docx
- 抓住“四个注重”,市资金办全面优化开发性金融服务环境1.doc
- 抓住一点,模拟量接线问题迎刃而解.docx
- 抓住中国中产阶层的商机.doc
- 68 Analyzing Graphs of Polynomial Functions .ppt
- 654 保留父类别的多载方法.ppt
- 64 离散系统的数学模型.ppt
- 6th Annual Economic Summit .ppt
- 6_3球面波的传播(动画)ppt.ppt
- 67信号通过线性系统的自相关函数能量谱和功率谱分析.ppt
- 浙江省临海市白云高级中学2025届高三历史3月月考试题.doc
- 云南拾谷县第一中学2024_2025学年高二物理上学期10月月考试题.doc
- 2025版高考生物总复习第13讲基因的分离定律教案苏教版.doc
- 湖北省黄石实验高中2024_2025学年高一历史下学期期末考试模拟卷.doc
- 通史版2025版高考历史大一轮复习专题七近代化的曲折发展__中日甲午战争至五四运动前4第4讲从维新思想到新文化运动课后达标检测含解析新人教版.doc
- 2024年高考数学考试大纲解读专题04导数及其应用含解析文.doc
- 河南省许汝平九校联盟2024_2025学年高一语文上学期期末考试试题扫描版无答案.doc
- 江西省吉安市吉水县第二中学2024_2025学年高一历史上学期第二次月考试题.doc
- 北京市平谷区2025届高三政治一模考试试题含解析.doc
- 2025届中考物理第四讲物态变化专项复习测试无答案新人教版.docx
文档评论(0)