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血清成分分析 血清的成分分析主要从血清中的胆固醇、清蛋白、γ-球蛋白、谷丙转氨酶等几个方面来进行研究的。我主要从实验的目的、原理、实验试剂、实验过程和结果几个方面来进行分析概括。 实验目的 了解并掌握邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇的原理和方法。 掌握盐析法分离提纯蛋白质的原理和方法；掌握透析法脱盐与蛋白质浓缩的方法； 掌握凝胶过滤层析的技术方法；掌握利用醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白的原理和方法。 用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用；用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力；学习治疗检测SGPT的方法及原理；了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。 实验原理 血清胆固醇的定量测定原理： 胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用。产生紫红色物质，此物质对550nm波长的光有最大吸收，可用比色法定量测定。100mL样品中胆固醇含量在400mg之内与吸光度呈良好线性关系。本法优点是操作简便（无须将样品中的胆固醇抽提出来或去除样品中的蛋白质），灵敏，稳定。 蛋白质盐析的实验原理： 1. 蛋白质分子是生物大分子，其大小恰好在胶体的范围，且分子中亲水基团多位于分子的表面，疏水基团多在分子结构内部。因此，蛋白质分子在水中能以胶体颗粒存在，形成胶体溶液。 2.蛋白质在水中形成亲水胶体，亲水胶体颗粒有两个稳定因素： （1）胶粒上的电荷；（2）水化膜。 3. 蛋白质在水溶液中呈现两性电离。在环境的pH≠pI时，蛋白质可带正电荷或负电荷。在某一pH条件，蛋白质带同种电荷，同电相斥，故可吸引水分子（水分子为极性分子），水分子排列围绕在蛋白质分子周围，形成水化膜，使蛋白质分子相互分割开来。破坏这两个因素或其中某一个因素（破坏了蛋白质胶体的稳定性），易于蛋白质发生沉淀。 4. 高浓度盐溶液，在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中和部分电荷。这样，就不同程度地去掉了上述的两个稳定因素，使蛋白质凝聚、沉淀，这就是蛋白质的盐析。 5. 由于各种蛋白质的颗粒大小、带电荷多少及亲水程度的不同，对于同一种中性盐，蛋白质盐析所需最低浓度也不同。 例如：球蛋白不溶于半饱和的NH4）2SO4溶液，γ-球蛋白不溶于1/3饱和度的(NH4)2SO4溶液，而清蛋白仅不溶于饱和的NH4）2SO4溶液。因而。可以利用不同浓度的NH4）2SO4溶液使血清或其他混合蛋白质中的这些不同的蛋白质分开。 蛋白质透析与浓缩的实验原理 1. 透析 （1） 透析是利用蛋白质等生物大分子不能通过半透膜的性质的一类纯化方法，可利用该方法分离大分子与小分子的混合物。 （2） 由于NH4+和SO42-可以通过半透膜，而血清清蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶液脱盐。 2. 浓缩 利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。 将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。 凝胶层析的实验原理 1. 凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术。 2. 当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的。 3. 当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。 醋酸纤维素薄膜电泳的原理 1. 醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。 2. 醋酸纤维素薄膜是用二乙酸纤维素制成的，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅为120μm，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为取代电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用广泛、没有吸附等特点。 谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）实验原理 观察肝糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肝糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。 血清谷丙转氨酶活力单位测定实验原理 本实验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位数。 三、实验器材和试剂 1.试管1.5cm×15cm（×7）、吸管0.1mL（×3）、0.5mL（×4）、5mL（×1）、10mL（×1