基因工程复习资.docVIP

一章 基因工程的基本原理 增加外源目标基因的剂量（分子遗传学原理） ? 筛选和重构控制重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、增强子、操作子、终止子、上游调 控序列等（分子生物学原理） ? 筛选和重构控制蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序列、mRNA非编码区、密码子等（分子生物学原理） ? 基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生 产（生化工程学原理） 基因工程的基本步骤 ?1. 外源目的基因的获得(切)2.基因载体的选择和分离纯化3. 重组DNA分子的构建(接)4.重组DNA分子导入宿主细胞(转)极其扩增(增5.重组菌（克隆株系）的筛选、鉴定和分析(检6.工程菌的获得、下游工艺的优化和目的基因表达产物的分离纯化。 重组DNA技术的定义——指将一种生物体（供体）的基因分离出来，和载体DNA在体外进行酶切和连接，拼接产生重组DNA，然后导入另一种生物体（受体）细胞中使目的基因得以复制和表达，能够按照设计者的意愿稳定遗传和表达出新产物或新性状的DNA体外操作技术，又称为基因克隆或分子克隆（技术）。 复制：以原来的分子为模板，合成相同分子的过程。 转录（或逆转录）：按照碱基互补原则，以DNA（或RNA）为模板合成相应的RNA（或DNA）的过程。 翻译：通过核糖体，以mRNA为模板，氨酰tRNA运送氨基酸，按照氨基酸的三联体密码规则合成相应蛋白质的过程。 第二章 载体的功能包括：能接受并将插入的外源重组基因高效转入受体细胞为外源重组基因提供完整的复制能力或整合能力;为外源基因的扩增或表达提供必要的条件. 载体应具备的基本特征包括：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）; 质粒是细胞内存在于染色体外并能独立于染色体DNA而进行自主复制和稳定遗传的一类核酸分子。 序列（如His-Tag等）噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效和特异性地侵染宿细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，上述两种状态在一定的条件下可以相互转化。 质粒的基本性质1自主复制性—质粒能够利用宿主细胞的DNA复制体系独立地进行复制并保持恒定遗传，由必要区和非必要区组成。 可扩增性—质粒在细胞内可扩增，有严紧型（低拷贝数：约1-3/5个/cell）和松弛型（高拷贝数：约10-60/200个/cell）两种复制形式。加 可传递—质粒在一系列特定转移基因的控制下，可通过接合作用在宿主细胞间进行自然传递。 不相容性—复制子结构与特征相同或相似的两种（或以上）不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内，这称之为质粒的不相容性。 自带有遗传标记形状—野生型的质粒DNA往往携带有≧1个特殊的遗传标记基因，导致宿主生物出现非正常生长需要的附加性状， 噬菌体的主要基本性质 噬菌体由衣壳蛋白包裹DNA（或RNA，较少）分子构成。常见的侵染模式分三步：（1）噬菌体附着到宿主细菌细胞的外表面，随后将自己的DNA注入到被侵染的宿主细胞中； （2）复制噬菌体DNA分子；（3）合成衣壳蛋白，组装新的子代噬菌体，并从细菌细胞中释放出来。 噬菌体侵染宿主细胞后，可选择溶菌或溶源这两条途径之一完成侵染循环。在溶菌途径中，完成上述三步过程的时间非常短，噬菌体DNA通常始终处于复制状态中，子代噬菌体的释放伴随有原细菌细胞的裂解。在溶源途径中，噬菌体DNA通常整合到宿主染色体DNA中以前噬菌体形式处于相对静止的状态，与宿主细胞可较长时间共存，直到原噬菌体重新被释放出来，进入溶菌途径为止。也有不同的溶源途径 λ-DNA载体的构建通常包括下列步骤： ? 除去非必须的片段 ? 删除重复的酶切位点（仅保留1-2个），添加新的单一酶切位点，构建多克隆位点； ? 灭活某些与裂解周期有关的基因，使噬菌体只能在特定条件下感染裂解细菌； ? 加装选择标记（免疫功能类标记、颜色反应类标记） ?根据需要构建密码子的琥珀突变体 ?-噬菌体载体主要有置换型载体和插入型载限制性核酸内切酶为二聚体或三聚体，催化反应需辅助因子，功能是识别双链DNA分子中的特定序列，并切割 DNA双链。（限制与修饰作用）限制性核酸内切酶包括I 型、II 型、III 型。 Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点 ?不同限制酶专一识别的核苷酸序列不同 ? 识别序列一般都具有回文结构 ?切割类型多种，切割后产生多种粘性末端或平口末端——粘性末端 ?在非标准反应条件下，可导致部分限制酶的专一识别位点序列发生改变同尾酶——识别序列不同，但切割后能产生相同的粘性末端的一类限制酶称为同尾 酶。 同裂酶——来源不同，识别序列和切点相同，产生相同末端的一类限制酶称为同裂 酶 1. 连接酶——T4 DNA连接酶：（1）双链DNA互补粘性末端之间和DNA缺口的连接；（2）平末端双链DNA分子之间的连接。热稳定的DNA连接酶：用于连接酶链式反应（LCR）