转EGFP—attB基因PK15细胞核型分析方法的建立.docVIP

转EGFP—attB基因PK15细胞核型分析方法的建立 　　摘要：以转EGFP-attB基因PK15细胞（猪肾细胞15）为试验材料，研究不同秋水仙素浓度、低渗时间对染色体标本制备的影响。结果表明，使用秋水仙素浓度为0.04～0.08 μg/mL、低渗时间为15～20 min时所制备的染色体标本分裂相分散好，可以做核型分析用，为下一步做染色体荧光原位杂交检测研究转EGFP-attB基因在染色体上的整合位点奠定了基础。 　　关键词：猪肾细胞15；转基因；EGFP-attB基因；核型分析 　　中图分类号：Q813 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5603-03 　　随着国家转基因生物新品种培育重大专项积极稳妥地推动实施，以及国家对转基因及生物育种的研究、安全性评价和管理的重视，人们对保护知识产权的意识逐渐加强[1-7]。目前，美、欧、日已经开始授权动物专利，而中国专利局暂不接受涉及动植物的产品权利。转基因动植物品种的育种人仅仅可对被转基因及其应用申请专利而间接保护转基因动植物或动植物品种，或对其非生物学的转基因方法及其应用申请专利保护，并以转基因方法专利延及保护该转基因方法直接获得的转基因动植物，所以，针对转基因育种素材中外源基因的检测越来越受到重视。转基因猪的插入序列一般整合于宿主细胞染色体上，常以染色体原位杂交的方法来确定插入序列整合在某一条染色体的具体位点。本研究利用转EGFP-attB基因PK15细胞制备染色体，为染色体原位杂交检测外源基因在染色体上的整合位点奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 试剂与仪器 DMEM培养液（Gibco公司），FBS（HyClone公司），PI（Sigma公司），无内毒素质粒提取试剂盒（Qiagen公司），Opti-MEM（Invitrogen公司），秋水仙素（Duchefa公司），Anti-digoxigenin-fluorescein、Nick-translation-Labeling-DNA-dUTP（Roche公司），正置显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）、载玻片及盖玻片（FanYi公司），LSM 510 META共聚焦显微镜（Zeiss公司）。 　　1.1.2 质粒 PhiC31整合酶表达载体pCMV-Int和报告载体pBCPB+由斯坦福大学Michelle M. Calos教授馈赠；表达载体pEGFP-N1、大肠杆菌DH5α、PK15细胞（猪肾细胞15）由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所生物技术研究室保藏。引物序列为：attB-F，5′-GTCATTAATCGCCATTCAGGCTGCGCA-3′；attB-R，5′-GTCATTAATCTCGGCCTCGACTCTAG 　　-3′。 　　1.2 方法 　　1.2.1 载体构建 以attB-F和attB-R为引物，PCR扩增attB基因序列，PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、dNTPs 2.0 μL、Taq DNA聚合酶1.0 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模版 0.5 μL，补ddH2O至25 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。利用Ase Ⅰ酶切attB基因序列和pEGFP-N1载体，连接后转化大肠杆菌DH5α，经PCR及酶切鉴定阳性克隆，构建为定点整合载体pEGFP-N1-attB。 　　1.2.2 细胞转染与筛选 500 ng pCMV-Int、10 ng pEGFP-N1-attB、1.2 μL Lipofectamine 2000、适量的Opti-MEM混合后室温下孵育20 min形成转染复合物，然后逐滴加到培养基中，8 h后更换新鲜培养基，24 h后加入600 μg/mL G418开始筛选。14 d后挑取单克隆，转移到6孔板扩繁、冻存。 　　1.2.3 探针标记 采用Roche试剂盒DIG-nick translation mix标记探针。取1 μg pEGFP-N1-attB质粒溶解于16 μL ddH2O中，加入4 μL DIG-nick translation mix，瞬时离心混匀后于15 ℃作用90 min，加入1 μL 0.5 mmol/L EDTA（pH 8.0）终止反应，然后加热至65 ℃使酶失活，-20 ℃保存备用。 　　1.2.4 染色体制备 在培养终止前加入不同浓度的秋水仙素，处理2 h，胰酶处理细胞，收获细胞，1 000 r/min离心5 min，用2～5 mL的0.56% KCl溶液低渗细胞，低渗