第01章蛋白质的结构与功能要点.ppt

蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 第五节 蛋白质的分离纯化与结构分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein 蛋白质的分离纯化 粗 分 精 制 备 原料的选择 一般步骤 蛋白质的分离纯化方法 分子大小 透析和超过滤：透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。 密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。 凝胶过滤：即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。 溶解度 等电点沉淀和pH控制 盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。 有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数，二是与蛋白质争夺水化水。 温度沉淀：温度对溶解度有影响，低温稳定，高温不稳定。在0~40℃，大部分的球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。 蛋白质分离纯化方法 电荷 电泳（净电荷、分子大小、形状） 区带电泳 聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE） 毛细管电泳 离子交换层析 等电聚焦：外加电场时，蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH处，形成区带。 层析聚焦：层析柱中建立连续的pH梯度，蛋白质样品由柱上端随缓冲液的展开而聚焦在各自的等电点pH处，形成区段。 吸附：吸附层析，吸附剂（硅石、氧化铝、活性碳）和疏水吸附剂，与待分离分子和杂质分子的吸附与解吸能力不同。 特异亲和力：亲和层析 其它：如高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC） 关于蛋白质鉴定和定量分析的表达蛋白质组学 蛋白样品 （非常复杂） 多肽混合物 （ 简单 ） 蛋白样品 （ 简单 ） 多肽混合物 （非常复杂） 数据库查询 多肽的鉴定 修饰的特点 定量 双向凝胶电泳 蛋白质芯片 多维液相色谱 质谱或串联质谱 * 蛋白质的二维电泳 二维电泳是分离蛋白质组的有效方法 蛋白质的质谱分析 （MS谱获得蛋白质的PMF；MS/MS可测定蛋白质的部分氨基酸序列） 应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链的氨基酸序列 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定 二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而?-折叠的CD谱不很固定。 三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。 同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐——补偿氨基酸替补、插入和缺失——通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高，预测的模型也越准确。 折叠识别：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。 从无到有：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构： 1、含有两个羧基的氨基酸是： A.赖氨酸 B.酪氨酸 C.苏氨酸 E.丝氨酸 2、关于蛋白质二级结构的叙述恰当的是： A.氨基酸的排列顺序 C.每一原子的相