14-分子发光光谱法.ppt

化学发光分析具有以下特点 1. 灵敏度极高 荧光素酶和ATP的化学发光分析，可测定2?10-17mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量 2. 仪器设备简单——不需要光源、单色器和背景校正 3. 发射光强度测量无干扰——无背景光、散射光等干扰 4. 线性范围宽 5. 分析速度快 缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。 二 基本原理 化学发光反应 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B C + D* D* → D + h? （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物 （2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 ?E 170～300 kJ/mol；位于可见光区； （3）发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体 萤火虫、海洋发光生物 中， 称为生物发光 bioluminescence 。 化学发光反应的类型 （1）液相化学发光 ——研究和应用的比较广泛的有鲁米诺（Luminol）光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。 鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定Cl2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2，产生化学发光反应时量子效率为0.01~0.05 鲁米诺（3 –氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中和H2O2等氧化剂反应生成最大波长为425 nm的光辐射 氧化剂 425 nm 反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光 可检测低至10-9 mol·L-1 的H2O2 鲁米诺H2O2的化学反应，可以被一些痕量的过渡金属元素所催化，使发出的光大大增强，由此可测定Co（Ⅱ）,Cu（Ⅱ）, Ni（Ⅱ）, Cr（Ⅲ），Fe（Ⅱ Ⅲ ），Ag（Ⅰ），Au（Ⅲ ），Mn Ⅱ ，Hg（Ⅱ ）Os（Ⅲ ⅣⅤ），Ru（Ⅵ），V（Ⅳ），Ir（Ⅳ）等金属离子，检测限由0.01~40 ?g·mL-1不等 利用鲁米诺发光体系可以测定50余种元素和大量有机和无机化合物，灵敏度都比较高 鲁米诺化学发光体系还可用于许多生化反应研究，常常涉及到H2O2的产生或H2O2参加反应 （2）气相化学发光 ——广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的O3；NO、NO2；SO2；H2S；CO；乙烯等。 在气相中O3能氧化NO、乙烯等产生化学发光，原子氧也能氧化NO、SO2、CO等产生化学发光 例： NO + O3 → NO2* + O2 NO2* → NO2 +h? （发射波长范围：600~875 nm） 常温下产生化学发光，测NO灵敏度可达1ng·mL-1测定范围0.01~10000 ?g·mL-1 CO + O（原子氧） →CO2* CO2* → CO2 +h? （? 300~500nm） 灵敏度为1 ng·mL-1 化学与生物发光分析的应用 （1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等 （2） 可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2； （3） 间接测定某些生物试样 氨基酸 + O2 ????? 酮酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖 + O2 + H2O ????? 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。 葡萄糖氧化酶 三、装置与技术 装置流程： 发光反应室 光检测器 信号放大器 显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差； 流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大； * 2. 荧光发射光谱 或磷光光谱 固定激发波长 选最大激发波长 , 化合物发射的荧光 或磷光 强度与发射波长关系曲线 图中曲线II或III 。 3.激发光谱与发射光谱的关系 a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长。 振动弛豫消耗了能量+溶剂的弛豫作用 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系。 三、荧光的产生与分子结构的关系 1. 分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构 （2）具有一定的荧光量子产率 荧光量子效率 荧光量子效率用φf 来描述 荧光量子