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基于代谢途径分析的多杀菌素高产菌株选育 　　摘要：通过对刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）多杀菌素代谢合成途径的分析，提出了一种代谢控制育种策略和提高诱变筛选效率的方法。以刺糖多孢菌QYLZ 88912菌株为出发菌株，选择不同照射时间分别对其进行紫外线照射处理，然后用含有不同抗性物质的摇瓶对诱变菌进行初筛，最终筛选出了1株高产多杀菌素的多抗性菌株SG+St+Er+-088。该菌株同时具有磺胺胍、链霉素和红霉素抗性，摇瓶发酵试验表明， 发酵7 d多杀菌素浓度可以达到1 132.60 mg/L，较出发菌株提高了85.4%，经传代试验证明此菌株高产遗传特性稳定。 　　关键词：代谢途径；代谢控制育种；多杀菌素；菌落形态 　　中图分类号：Q819； Q815 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2309-06 　　当前中国农药的应用可以简单地总结为农药品种多、质量低、用量大、效率低、农产品中残留量高，对环境污染严重[1]，因此开发高效绿色的新型农药显得尤为重要。多杀菌素（Spinosad）又称刺糖菌素，是由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）通过有氧发酵聚酮合成途径合成的大环内酯类抗生素，兼有化学农药的速效性和生物农药的安全性，不会对环境产生污染，对鱼、畜、禽安全系数高。多杀菌素作为一种绿色生物农药，其具有杀虫谱广、作用方式独特、杀虫活性高、半衰期短、残留低、无抗药性、对人畜无害、环境污染少等优点[2]，是一种具有触杀及胃毒毒性的新型微生物源杀虫剂，于1999年获得美国“总统绿色化学品挑战奖”[3]，在农牧业生产中具有广阔的应用前景，该类产品的开发也具有良好的经济效益和社会效益。 　　刺糖多孢菌属于糖多孢菌属（Saccharopolyspora），是迄今发现的惟一可以通过好氧发酵产生多杀菌素的菌株。目前国外多杀菌素的研究领域已延伸到开发杀虫活性更高、生物安全性更好的衍生物上。国内对发酵生产多杀菌素的研究起步晚，最近几年也取得了很大的进展，但较国外研究水平还有很大的差距[4]。国内报道多杀菌素高产菌株较高生产水平为800～1 260 mg/L[5，6]，而国外早在10多年前就实现了工业化生产。多杀菌素的制备方法主要为微生物液体发酵合成，生物合成多杀菌素具有突出的优点，工艺条件较易控制、产品质量稳定、提取较为方便，但微生物液态发酵生产多杀菌素产量很低，主要问题是缺乏高产菌株，以致影响了该物质的应用。因此筛选高产菌株，为中国农药领域开辟新型绿色产品，对农牧业生产具有重要的意义。试验运用理性筛选思路和高效诱变方法，筛得高产菌株，并对其进行生物化学和遗传学分析。 　　1 材料与方法 　　1.1 供试菌种 　　刺糖多孢菌QYLZ 88912菌株，由天津北洋百川生物技术有限公司保藏。 　　1.2 培养基 　　保藏分离培养基：可溶性淀粉20 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母提取物3 g/L，玉米浆10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，琼脂20 g/L，pH 6.5～6.7 ， 121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。 　　种子培养基：可溶性淀粉20 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母提取物3 g/L，玉米浆10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，pH 6.5～6.7，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。 　　发酵培养基：葡萄糖 40 g/L，可溶性淀粉 30 g/L，玉米浸液 15 g/L，棉子浓缩粉 20 g/L，酵母粉 20 g/L，碳酸钙 3 g/L，pH 7.0～7.2 ， 121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。 　　1.3 主要试剂 　　试验所用主要试剂情况见表1。 　　1.4 菌株QYLZ 88912对所用抗性物质的耐受上限试验 　　将出发菌株的孢子悬浮液涂布于含有不同抗性物质、不同设计水平的平板，每个处理做3个平行，在相对湿度70%～80%、29 ℃的培养箱中培养7～9 d，观察抗性平板的菌株生长情况，确定出发菌株对所用抗性物质的致死（耐受）上限。 　　1.5 菌株的诱变处理 　　1.5.1 孢子悬浮液的制备 选择生长良好的多杀菌素出发菌株QYLZ 88912斜面菌种，用无菌生理盐水将其孢子洗下，转入装有玻璃珠的无菌三角瓶中振荡30 min，使孢子充分分散，用脱脂棉过滤孢子悬浮液，并调节孢子悬浮液浓度为106～107个/mL，备用。 　　1.5.2 致死率测定 取处理好的孢子悬浮液于30 W紫外灯下30 cm处分别照射不同的时间进行诱变处理，将诱变后的孢子悬浮液梯度稀释涂于保藏分离培养基平板，于29 ℃避光培养7～9 d，计算致死率。 　　1.6 分析方法 　　1.6.1 色谱分析 高效液相色谱仪Ag