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核果类果树遗传转化及检测技术研究进展 　　摘要：综述了近年来国内外常见核果类果树遗传转化的研究进展，概述了目前果树遗传转化的主要方法，阐述了核果类果树遗传转化植株的主要鉴定方法，指出了当前研究中存在的一些问题，探讨了转基因研究未来的发展方向。 　　关键词：核果类果树；遗传转化；检测技术；发展方向 　　中图分类号：S662；Q789文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）04-0130-07 　　核果类果树是指蔷薇科李属（Prunus）、果实为核果的一类果树，包括桃、杏、李和樱桃等，是我国落叶果树的重要种类。果树长期的育种实践表明，常规杂交育种方法对核果类果树种质改良有很大的局限性；基因工程育种周期短，基因资源丰富，能最大限度地克服物种生殖隔离的障碍，实现生物界遗传物质的自由交流。自1988年首例转基因核桃成功报道以来[1]，基因转化方面的研究在果树遗传转化研究上得到了广泛应用，其在果树遗传改良中的作用越来越受到重视。本文主要综述了近年来国内外在核果类果树遗传转化方面所取得的进展，为基因工程育种提供参考和借鉴。 　　1常见核果类果树遗传转化的研究现状 　　11桃 　　桃转基因难度较大，多数研究只获得了转基因的愈伤组织而未能获得转基因植株。1991年Smigocki和Hammerschlag[2]用未成熟桃胚为外植体，经过愈伤组织诱导和再分化，成功将细胞分裂素合成酶基因（IPT）导入了桃，这是世界上首例也是目前为止唯一公开报道的转基因桃实例。农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法在桃遗传转化研究中均有报道[3～6]。 　　Smigocki等[8]早期利用Ti质粒中含细胞分裂素合成酶基因和生长素酶突变基因的根癌农杆菌与桃的成熟细胞共培养进行感染，获得了桃转化细胞及愈伤组织。Martin[9]曾用2种发根农杆菌和8种根癌农杆菌感染桃，证明了以GUS基因作为桃遗传转化的报告基因和测试包含GUS基因标记系统的农杆菌的有用性。Ognjanow[10]用带有GUS基因的农杆菌感染桃子叶转化体，GUS荧光检测与阴性对照明显不同。Hammerschlag等[11]用农杆菌tma328∶tn5转化桃成年树离体茎段，均产生了肿瘤组织，并表现出不依赖细胞分裂素的特性，转化体DNA呈阳性，初次说明了成年桃树的细胞能够被转化及根癌菌具有转化重要基因到桃树上的潜能。1991年他们又用tma328∶tn5感染未成熟桃胚，将共培养后的外植体接种在无激素的MS培养基上，诱导产生愈伤组织，这些愈伤组织在分化培养基上分化产生了芽。Ye等[6]用基因枪法轰击桃未成熟胚、胚轴、子叶、茎尖、叶片和长期胚性愈伤组织转化GUS/NPTⅡ嵌合基因，所有类型的外植体均获得了GUS基因瞬时表达，并在长期胚性愈伤组织中得到稳定表达。他们筛选出了桃组织遗传转化的最优组合，并用微粒轰击法使外源基因成功导入桃胚愈伤组织并得到稳定表达。金勇丰等[12，13]已先后从桃品种“玉露”克隆了ACC氧化酶和ACC合酶的基因，且已构建其反义植物表达体系，若转化桃获得成功，可望阻抑果实软化期该基因的表达，从而提高果实的耐贮性。现已成功获得导入了ACC氧化酶反义基因的转基因桃植株[12]，目前正在培育以观察转基因果实的性状。 　　李曜东等[14]将肥城桃反义PG基因通过农杆菌介导转化组培苗，转化苗在含卡那霉素培养基上筛选，获得抗卡那霉素转基因苗。吴延军等[15]以桃幼胚作为根癌农杆菌介导转化的受体，通过GUS基因瞬时表达率的分析，研究出了该转化体系的最佳实验参数，GUS瞬时表达率最高。Pérez-Clemente等[3]2004年报道以GFP为内部标记鉴定转基因桃树。万春雁等[7]2009年对桃花粉管通道法转基因技术进行初步研究，探索一种建立于组织培养之外的转基因方法。 　　12李 　　除了桃，其它核果类果树的遗传转化研究也得到广泛开展。1991年，Mante等[16]首先实现了西洋李转基因，目前已在波兰、罗马尼亚和西班牙等3个不同气候条件的国家进行了温室和大田试验。Scorza等[17，18]在李树上转化木瓜环斑病毒（PRV）外壳蛋白基因，并就转基因植株对李痘病毒（PPV）的反应进行了初步研究。1994年，Scorza等[19]成功利用带有重组质粒PGA482 gg/PPV-CP-33的致瘤农杆菌与下胚轴切段共培养获得了转PPV外壳蛋白基因的欧洲李转基因茎，在欧洲和地中海地区用于防治核果类重要病害的发生。Ravelonandro等[20～23]先后几年致力于利用转基因技术抵御李痘病侵染的研究；Yancheva等[24]利用农杆菌介导法进行了李树遗传转化的研究；Malinowski等[25]2006年成功进行了李树转PPV-CP基因的田间试验；2008年Urtubi