红花中黄酮类化物抑制基质金属蛋白酶活性的实验研究.docVIP

第一章 前 言 1.1 红花简介 Carthamus tinctorius L． 为菊科植物，红花属红花的干燥花，生长周期为1~2年，在国际上，印度、美国、埃塞俄比亚、澳大利亚等地为红花主要种植地，在我国则主产于河南、云南、浙江等地，由于其在种植方面有较好的抗旱、耐盐碱、抗寒、用途广泛等诸多优点，在我国栽培种植已经有两千多年的历史[] 在历史，红花被赋予了多种意义，不仅可以用来用，还可用于食用、染料和油料虽然红花成分较为复杂，已分离鉴定的化学成分有60多种，主要分为黄酮类、木脂素类、多炔类等几大类存在着200多种色素类成分含有丰富的黄色素和红色素，是一种纯天然染色剂。其他类型的黄酮类物质，主要有山奈酚（Kaempferol）和槲皮素（Quercertin）为基本母核的一系列衍生物及芦丁（Rutin）杨梅素（Myricetin），芹黄素（Apigenin），木樨草素（Luteoline）等红花中查尔酮类化合物多为色素类成分，而其中最重要的就是红花黄色素（safflower yellow，SY）。SY由红花黄色素A和红花黄色素B及其衍生物组成，羟基红花黄色素（Hydroxyl safflower yellow A，HSYA）的研究最为广泛，日本学者龟高德平首先从我国河南承德红花干花中分得红色素（含0.3%～0.6%它是红花中含量最高的成分。1.2基质金属蛋白酶（MMPs）简介 ECM（extracellular matrixc）是一种存在于细胞间隙中的大分子物质其临床方面对于研究肿瘤转移有着极其重要的意义，应用蛋白酶降解ECM是治疗多种疾病的有效方法如强直性脊柱炎，心脑血管疾病，肿瘤，糖尿病，炎症等[]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类与Ca2+，Zn2+金属离子结合，可对ECM有极强降解作用的超酶家族，据现阶段研究表明MMPs已鉴定出28种，其又可以分为5大类，分别为胶原酶、明胶酶、基质裂解酶、膜型金属蛋白酶、其它型。这里，胶原酶主要包含MMP-1、MMP-8、MMP-13，明胶酶主要包含MMP-2、MMP-9，基质裂解酶主要包含MMP-3、MMP-10、MMP-11，膜型金属蛋白酶主要包含MMP-14，MMP-15，MMP-16、MMP-17、MMP-24、和MMP-25。酶本身的活性点不同，这种不同主要由于染色体序列不同所导致，由此各蛋白酶对应的底物与抑制剂也各有不同MMPs活性的抑制对肿瘤细胞的行为有重要的影响，而MMP-2的活性也与癌栓及肿瘤大小密切相关[ 13~ 15]。本实验研究红花体外抑制基质金属蛋白酶- 2活性的作用及抗肿瘤机理，从而为从分子水平上研究红花的治病机理奠定基础，也为进一步从红花中提取基质金属蛋白酶抑制剂提供实验依据。第二章 实验部分 2.1 实验材料、试剂 红花药材购买于北京同仁堂大药房（长春汽车厂分店）。羟基红花黄色素A（Hydroxyl safflower yellow A，HSYA）标准物质购于中国药品检验所（北京）、红花黄色素B（Anhydrosafflor yellow B，SY-B）标准品为实验室自主分离（纯度达98%）。HEPES（Promega）基质金属蛋白酶-2（MMP-2，Sino-Bilogical），GM-6001（ENZQ），0.05% Brij-35（SANTA），荧光底物DQTM）GELTIN FROM PIG（Life），无菌水，DMSO等。 2.2 仪器设备 96孔酶标板（鼎国）Beckman），恒温培养箱 2.3 样品pH 7.0），其成分为50 mM HEPES、0.2 M NaCl、10 mM CaCl2、20 μM ZnSO40.05% Brij-35。精密称取适量广谱MMP的抑制药物GM-6001，用DMSO溶解，配置成15 nmol/L GM-6001溶液待用，于-20℃下保存。精密称取适量荧光底物DQ-gelatin，用HEPES缓冲溶液溶解，配置成每50 L缓冲溶液中含有0.2 g的DQ-gelatin溶液待用，于-20℃下保存。 称取100 g 红花药材粉末（过40目筛），75%乙醇室温下浸泡提取6次，每次提取12小时，将75% 乙醇提取液过滤合并，减压浓缩得水液。水液部分用石油醚脱脂2次，弃去石油醚溶液，再用乙酸乙酯溶液萃取5次，弃去乙酸乙酯溶液，水溶液减压回收蒸干，得到红花水提取物。称取适量的红花水层提取物，超纯水溶解过0.45 m 滤膜，配置成浓度为10 mg/mL，8 mg/mL，5 mg/mL，2 mg/mL，1 mg/mL的样品溶液。于-20℃下保存，用于抗炎活性测定。 精密称取羟基红花黄色素A和红花黄色素B两种标准品适量，加超纯水溶解，分别配置成浓度为10 m