基因的克隆表达剖析.pptVIP

一、概述 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆子载体是DNA而不是蛋白质 揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理 提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码 基因克隆（分子克隆molecular cloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。 二、克隆载体 复制基因 replicator 选择性记号 克隆位点 据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。 二．原核生物基因结构和表达特点 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。 3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。 共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。 包括：调控区 调节基因，启动基因， 操作基因 、 结构基因 5、原核生物中参与转录的基因结构： 启动子 终止子 启动子 promoter, P 是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 具有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区： RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录 各种启动子启动转录能力不同。 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列 终止子（terminator，T）:位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 6、与转译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点 转译起始密码子AUG 或GUG SD顺序（shine-dalgarno）： AUG上游3-11 bp 长约3-9bp mRNA与16s核糖体亚基间的识别与结合序列 三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件： 删除内含子和5’非编码区 外源基因置于强启动子和SD顺序控制下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素： 1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。 常见原核强启动子： Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导 Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。 Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。 PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。 2、基因剂量： 3、核糖体结合位点： SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。 AUG—SD间距离。 AUG后的核苷酸 五．原核表达载体：? 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。 主要元件：强启动子 SD顺序 筛选标志 其它调控基因 类型： 融合型表达载体：----融合蛋白 非融合型表达载体：---天然完整蛋白 分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙 （一）融合型表达载体 P SD Foreign DNA 融合型表达载体 融合基因 技术关键：克隆基因插入原核序列3’端而维持正确阅读框架。 选择合适酶切位点 加人工合成的DNA接头 构建位相载体 ----ATG ---- AAC CTG GAA TTC CTA GGT --- ----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA--- EcoRI BamHI AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA 载体部分序列 DNA序列 * 基因的克隆与表达 基因克隆 gene cloning 基因表达 gene expression -原核基因表达 -真核基因表达 基 因 克 隆 Gene Cloning 概述 克隆载体 受体细胞 体外重组的策略 基因克隆工作流程 1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌 所需元件： 限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞 基因克隆的核心-----体外重组 Recombination : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 基因克隆的技术路线 目的基因 载体 体外重组 重组子（杂合DNA） 转化 受体细胞 筛选阳性克隆 大量扩增，获得子代DNA