第三章电泳技术详细分析.pptVIP

第二章 电泳技术electrophoresis technology 第一节 概述 一、电泳技术的概念 在直流电场中，带电粒子向与其电性相反的电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。 利用各种带电粒子电泳速度不同，对物质进行分离，然后对物质进行定性和定量的分析方法称为电泳分析法，也叫电泳技术。 二、电泳技术的分类 电泳技术的分类方法有多种，可从分离目的、电场强度、电泳媒介、电泳装置、缓冲液pH等不同角度进行分类。 （一）按照电场强度的不同，分为常压电泳和高压电泳 常压电泳的电场强度一般在2~10V/cm（电压在500V以下） 高压电泳的电场强度一般在20~220V/cm（电压在500V以上） （二）按照电泳媒介不同（有无支持物），分为自由电泳和区带电泳 1．自由电泳 自由电泳的媒介为溶液（不用支持物），带电粒子在溶液中自由移动，适用于生物细胞和生物大分子的电泳分离，如显微电泳、等电聚焦电泳、密度梯度电泳等。 2．区带电泳 媒介为支持介质，被分离的物质经电泳后在支持介质上形成区带称为区带电泳。区带电泳是目前应用最广泛的一种电泳技术，适用于蛋白质、核酸等标本的分离。区带电泳根据支持介质的不同又分为滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 （三）按照分离目的的不同，分为分析电泳和制备电泳。 （四）按照支持物的装置形式（电泳装置）不同，分为水平电泳（支持物水平放置，最常用）和垂直电泳等。 （五）按照缓冲液pH值是否均一分为连续pH电泳和不连续pH电泳。 1．连续pH电泳 支持介质各处的pH相同，如滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳等。 2．不连续pH电泳 支持介质各处的pH不同，聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等。 聚丙烯酰胺凝胶电泳连续pH电泳与不连续pH电泳的主要区别在于：不连续pH电泳有两种不同孔径的凝胶系统；电泳槽中及两种凝胶中所用的缓冲液pH值不同；电泳过程中形成的电势梯度也不均匀。而连续pH电泳在这三方面都是单一或是均匀的。 三、电泳技术的特点 1．凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析。 2．分辨率高。 3．可在常温下进行。 4．样品用量少。 5．操作省时简便。 6．设备简单。 第二节 电泳技术的基本原理 一、电泳迁移率 在单位电场强度下，带电粒子的移动速度称为电泳迁移率（electrophoresis mobility）。用μ表示电泳迁移率，v表示电泳速度（cm/s），E表示电场强度（V/cm），则： μ v/E cm2/ V·s 在电场中，推动带电粒子运动的力（F：电场力）等于粒子荷电量（Q）与电场强度（E）的乘积，即： F QE 带电粒子的前移同样要受到阻力（F’：摩擦力）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即： F’ 6πrηv 式中r为质点半径，η为介质粘度系数，v为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：F F’，即QE 6πrηv，由此得出： v EQ/ 6π·r·η 将μ v/E代入，得： μ Q/ 6π·r·η （1） 从上式可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电荷成正比，与其半径及介质粘度系数成反比。所以电泳迁移率是物质的特征常数。 表2-1 血清蛋白等电点与电泳迁移率 二 、影响电泳迁移率的因素 影响电泳迁移率的外界因素还有以下几种： （一）电场强度 电场强度也称电势梯度，是指单位长度（每1cm）的电压降（电位降）。 常压电泳的电场强度一般为2～10 V/cm，高压电泳的电场强度一般为20～200V/cm。常压电泳多用于分离蛋白质等大分子物质，高压电泳则用来分离氨基酸、小肽、核苷等小分子物质。 例如：以滤纸作支持物，其两端浸入电极缓冲液中，电极缓冲液与滤纸交界面的纸长20cm，测得的电压降为200V，那么，电场强度为200V/20cm 10V/cm。 （二）电泳缓冲液 电泳缓冲液起着决定粒子电荷性质和电荷量的作用，同时起导电作用，电泳时对缓冲液的化学组成、pH值和离子强度都有一定的要求。 1．缓冲液的化学组成（缓冲溶质） 缓冲体系的组成常选用弱酸/弱酸盐、酸式盐/次级盐。对缓冲液的要求是化学性质稳定、电导率低、缓冲容量大、粒子移动性好。按此要求，缓冲液的pH值确定后，第一，选择缓冲液时要尽量选择pKa接近缓冲液pH的弱酸成分，此时缓冲容量最大。第二，优先选用离子价数为1价的电解质，目的是保持离子的活度。第三，优先选择正、负离子移动速度相近的电解质，使电泳时离子分布均匀，保证电泳区带的整齐。 常用的缓冲液有巴比妥/巴比妥钠、柠檬酸/柠檬酸钠、NaH2PO4/Na2HPO4、Tris/HCL等。巴比妥/巴比妥钠是血清蛋白电泳常用的电泳缓冲液。 2．pH值 溶