中华按蚊CYPG17基因的鉴定及生物信息学分析.docVIP

中华按蚊CYP4G17基因的鉴定及生物信息学分析* 闫正文，张玉娟，周勇，陈斌 (重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所重庆市动物生物学重点实验室，重庆 401331) 摘要:细胞色素P450酶系广泛分布于所有需氧生物体中，参与生物体内多种内源性物质和外源性物质的代谢，因其在昆虫抗药性中发挥重要作用，而受到广泛关注。本研究基于中华按蚊(Anopheles sinensis)转录组，通过同源性搜索鉴定出一条中华按蚊CYP4家族序列，生物信息学分析将该基因命名为AsCYP4G17（GenBank登录号：KP004246），该序列全长1962 bp，其中编码区1671 bp，编码556个氨基酸。同源性分析表明该基因与冈比亚按蚊CYP4G17氨基酸序列相似性最高(Identity=89%, Similarity=94%)。该基因编码的蛋白质相对分子质量为63.48 kD，等电点为7.70。该蛋白第20～39位氨基酸为疏水区，蛋白质亚细胞定位显示该蛋白质位于细胞质中。基因结构分析显示，该基因含有两个相位2型内含子。本研究为进一步揭示中华按蚊CYP4G17的功能奠定了基础, 对阐明昆虫杀虫剂抗性机理具有一定的科学意义。 关键词：中华按蚊；CYP4G17；鉴定；生物信息学分析 疟疾是一种以按蚊为传播媒介的虫媒传染病，是最重要的媒介传播疾病，是全球主要的健康问题[1]。仅2012年，全球就有2.07亿人感染疟疾，造成约62.7万人死亡。蚊媒的控制是防止疟疾传播的有效方法。目前蚊媒控制主要通过室内滞留喷洒和杀虫剂处理过的蚊帐[2]。然而随着杀虫剂的广泛使用，许多蚊媒已经对杀虫剂产生了抗药性。这对蚊媒传播疾病的控制造成了重大的威胁，尤其是对疟疾的控制。因此，蚊媒对杀虫剂的抗性机制已经成为一个迫切需要研究的课题。 中华按蚊(Anopheles sinensis)是我国和东南亚地区主要的疟疾传播媒介[3]，研究表明其已对多种杀虫剂产生了一定程度的抗药性。而且在中国和韩国，中华按蚊已对拟除虫菊酯表现出高水平的耐药性[4]。昆虫对杀虫剂的抗性机制是一个非常复杂的问题，主要包括行为抗性和生理抗性，如蚊虫倾向于回避杀虫剂，表皮穿透性的降低，靶标位点敏感度降低和解毒酶活性增强。而在蚊虫中抗性主要与靶标位点敏感度降低和解毒酶活性增强有关[5]。昆虫体内主要包括3类解毒酶：细胞色素P450(CYPs)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)和羧酸酯酶(CCE)[6]。其中，参与杀虫剂代谢的细胞色素P450是昆虫产生抗药性的主要机制，该机制也造成大多数媒介昆虫对杀虫剂产生高水平抗性和交互抗性[3]。就目前广泛使用的菊酯类杀虫剂而言，昆虫对该类杀虫剂产生抗药性的主要原因为细胞色素P450表达量上升而介导的杀虫剂代谢作用[5, 7]。通常认为，CYP6家族成员与昆虫抗药性密切相关，但近年来研究表明CYP4家族成员也可能与昆虫抗药性相关[8]。已有研究表明，阿拉伯按蚊(An. arabiensis)中CYP4G16和CYP4H24与溴氰菊酯抗性相关，致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)中CYP4H34与氯菊酯抗性相关，尖音库蚊(Culex pipiens)中CYP4H21与溴氰菊酯抗性相关[5]。目前只有少量与中华按蚊抗性相关的基因被报道。 本研究基于中华按蚊转录组数据，通过同源性搜索得到一条CYP4家族序列进行了深入研究，分析了其序列特征、蛋白质结构，构建了系统发育树(neighbor-joining method, NJ),并对其基因结构进行预测。本研究为进一步研究中华按蚊CYP4G17基因的功能奠定了理论基础,对阐明昆虫杀虫剂抗性机理具有潜在的科学意义。 1 材料与方法 1.1 数据来源 中华按蚊转录组数据（SRA登录号：SRA073189）来自于重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所，中华按蚊基因组数据、冈比亚按蚊(An. gambiae)、达林按蚊(An. darlingi)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)等昆虫的P450同源序列分别在VectorBase数据库(/)和NCBI的GenBank数据库(/)两个数据库中下载。 1.2 序列鉴定 以冈比亚按蚊的CYP4G17氨基酸序列作为query序列,TBLASTN(E-value≤1e-5)搜索中华按蚊转录组数据库。搜索得到的候选基因进行手工校对后，NCBI在线BLASTP检索nr库，进一步完成序列的验证。 1.3 序列分析 鉴定中华按蚊CYP4G17 cDNA序列的开放阅读框并翻译成氨基酸序列使用软件DNAMAN7.0；使用软件BioEdit统计cDNA序列的碱基组成；使用BLAST工具(/BLAST/)进行序列同源性检索；利用Codon