第十一章 原生质的分离和培养.docVIP

第十一章 原生质体的分离和培养 1 引言 原核生物遗传饰变过去几十年取得了很大进展，转导和转化现已成为对微 见第9章和第10章 ，这是通过 体细胞杂交 。无论是在1960年以来，由于Cocking证实了通过酶解细胞壁可以获 原生质体 ，对高等植物体细胞遗传饰变的真正兴趣才1970．年以后——才活跃起 高等植物原生质体除了可用于细胞融合的研究以外，还能通过它们裸露的DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。原生质体的这些特性与植物细胞 通过原生质体系统对植物细胞进行遗传饰变方法的要点是：①原生质体的11．1，与体细胞杂交有关的细胞融合和离体原生质体在其他方面的12章中讨论。 图11．1 叶肉原生质体的分离、培养和植株再生 71自Bajaj，1977 11．2原生质体的分离 11．2．1原生质体分离的方法 11．2．1．1机械法 由高等植物中分离原生质体的研究最早是Klercker在1892年进行的。当 11．2．1．2酶解法 1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分离原生质体的 Myrothecium verrucaria 培养物制备的高1968年纤维素酶和离析酶投入市场以后，植物原生质体 首先用商品酶进行原生质体分离的是Takebe等 1968 。在他们分离烟草Power和Cocking 1968 证实，这两种酶也可一起使用。这种“同时处理法”或11．1。现 表11．1 ．取决于组织性质的不同，它们可以不同 表11．1 存厦毕后佐分离审常用的商品醢 Onozuka R一10 Meicelase P Cellulysin DriseIase 绿色木霉 绿色木霉 绿色木霉 Irpex lutens Yakult Honsha Co．Ltd．，Tokyo，Japan Meiji Seika Kaisha Ltd．，Tokyo，Japan Calbiochem．，San Diego，CA 92037，USA Kayowa Hakko Kogyo Co．，Tokyo，Japan 果胶酶类 Macerozyme R-lO Pectinase Pectolyase Y－23 根霉 黑曲霉 日本黑曲霉 Yakult Honsha Co．Ltd．， Tokyo，Japan sigma Chemical Co．，St．Louis，MO 63178，USA seishin Pharm．Co．Ltd．，Tokyo，Japan 半纤维素酶类 Rhozyme HP-150 Hemicellulase 黑曲霉 黑曲霉 Rohm and Haas Co．，Philadelphia，PA 19105，USA Sigma Chemical Co．，St．Louis，M0 63178，USA 由于商品酶的出现，现在实际上已有可能由每种植物组织分离出原生质体， 有活力和适于培养的原生质体的大量分离受到若干因素的影响，一个实验Uchimiya和Murashige 1974 在烟草培养细胞上所做的工Scott等 1978 在禾谷类植物叶肉组织上所做的工作 见表11．2 。 表11．2在两个物种中原生质体分离的最适条件 目 烟草的培养细胞① 禾谷类叶肉细胞② 植物材料 纤维素酶 果胶酶 离析酶 半纤维素酶 酶溶液的pH 酶溶液容积／组织鲜重 保温时间 最适温度 振荡速度 渗压剂 4～5日龄继代培养物 1％Onozuka R－10 O.1％～O.2％Onozuka R－lO —— 4.7或5.7 10 ml／g 2～3 h 22～37℃ 50 r／min 300～800 mmol／L甘露醇 5～6日龄幼苗 2％Cellulysin O.5％ 1％ 4.6～5.4 10 m1／g 2 h 20～25℃ 80 r／min 600 mmo|／L山梨醇 ①引自Uchimiya和Murashige 1974 ；②引自Scott等 1978 。 由叶肉细胞分离原生质体的方法见附录11．1 同时见图11．2 。 图112 分离叶肉原生质体的技术流程 引自E．C．Cocking 11．2．2影响原生质体产量和活力的因子 11．2．2．1材料来源 植物原生质体最方便和最普遍的来源是叶片，因为由叶片中可以分离出大 1 000 μW／cm。 ，短日照，温度范围20～25，相60％～80，以及充足的氮肥供应。 由于从禾本科和其他一些物种的叶肉细胞分离适于培养的原生质体相当困 每3 d一次 的悬浮培养 11．2．2．2前处理 由生长在非无菌条件下的植株上取来的组织，首先必须进行表面消毒。一般2章中介绍的用于组织和器官培养的消毒方法相同。根据Scott等 1978 的实验结果，对禾谷类植物叶片进行表面消毒时，效果最好效率 Zephiran O.1